[發明專利]用于產生化合物的組合物和方法

在審

• 申請號: 201780030563.7
• 申請日: 2017-04-12
• 公開（公告）號: CN109641062A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: B.R.鮑曼;J.A.V.布洛杰特;G.L.維爾丁;D.C.格雷;J.P.摩根-斯特恩;L.富爾斯頓;K.羅比森
• 申請（專利權）人: 華普卓威生物公司
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;C07D307/33;C07K14/035
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 彭昶;周李軍

本公開提供了編碼轉錄因子LuxR家族的大ATP結合調控因子(LAL)的核酸、包括此類核酸的載體和宿主細胞以及用于使用此類核酸、載體和/或宿主細胞產生化合物(例如聚酮或β?內酰胺化合物)的方法。

背景

轉錄活化因子LuxR家族的大ATP結合調控因子(LAL)為諸如FK506或雷帕霉素(rapamycin)的聚酮的已知轉錄調控因子。已發現LAL家族在誘導一些類型的天然產物基因簇的表達中具有積極作用，例如PikD對于苦霉素產生以及RapH對于雷帕霉素產生。LAL蛋白含有三個結構域；核苷酸結合域、誘導劑結合域及螺旋-轉角-螺旋(DNA結合)結構域。DNA結合域的結構為四螺旋束。該基序中螺旋3的特定蛋白殘基序列將LAL引導至原核轉錄啟動子區中所含的特定DNA序列(即，LAL結合位點)。復合物中的LAL或多個LAL結合至產生小分子的基因簇(例如聚酮合酶基因簇或產生β-內酰胺化合物的蛋白質基因簇)內的基因啟動子中的特定位點，增強基因簇的表達并且因此促進化合物(例如聚酮或β-內酰胺化合物)的產生。因此，通過優化對產生小分子的對應基因簇(例如PKS基因簇或β-內酰胺化合物基因簇)的調控有機會開發出產生更高效和/或增加的化合物(例如聚酮或β-內酰胺化合物)產生的組合物和方法。

發明概述

本公開提供了編碼重組LAL的核酸、包括重組LAL的載體和宿主細胞以及在用于產生化合物(例如聚酮、脂肪酸、類萜、非核糖體多肽、β-內酰胺化合物以及生物堿)的方法中使用這些核酸、載體以及宿主細胞的方法。因此，在第一方面中，本公開提供了一種經過工程化以表達重組LAL(例如異源LAL)的宿主細胞(例如天然缺乏LAL和/或LAL結合位點的宿主細胞)。在一些實施方案中，LAL為組成活性的。在一些實施方案中，通過在核酸中插入LAL結合位點將宿主細胞工程化。在一些實施方案中，重組LAL結合至LAL結合位點促進核酸(例如編碼諸如聚酮合酶或產生β-內酰胺化合物的蛋白質等產生化合物的蛋白質的核酸)的轉錄。在一些實施方案中，LAL結合位點對于LAL為異源的。在一些實施方案中，LAL結合位點對于LAL為內源性的。在一些實施方案中，LAL結合位點包括序列GGGGGT。

在一些實施方案中，宿主細胞包括包含異源LAL結合位點的核酸，所述異源LAL結合位點可操作地連接至開放閱讀框，使得LAL結合至異源LAL結合位點促進開放閱讀框的表達。在一些實施方案中，異源LAL結合位點為合成LAL結合位點。在一些實施方案中，異源LAL結合位點與可操作地連接至開放閱讀框的內源性LAL結合位點相比更大程度地促進表達。在一些實施方案中，異源LAL結合位點包括C₁-T₂-A₃-G₄-G₅-G₆-G₇-G₈-T₉-T₁₀-G₁₁-C₁₂(SEQ IDNO:2)的至少8個連續核苷酸，其中除了G₄、G₅、G₆、G₇、G₈、T₉以及T₁₀中的任何三個核苷酸(例如G₄、G₇以及T₉；G₅、G₈以及T₁₀；或G₆、G₇以及G₈)以外沒有一個或最多六個核苷酸由任何其他核苷酸置換。

在一些實施方案中，重組LAL包括與SEQ ID NO:1的序列具有至少70％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％)序列同一性的部分。在一些實施方案中，重組LAL包括具有SEQ ID NO:1的序列的部分。在一些實施方案中，重組LAL具有SEQID NO:1的氨基酸序列。