[發明專利]轉染植物和減少隨機整合事件的方法

有效

• 申請號: 201780028985.0
• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN109196105B
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 馬塞爾·蒂斯特曼;瑪爾杰·范克雷滕;保羅·霍亞卡斯
• 申請（專利權）人: 萊頓大學;萊頓教學醫院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本公開提供了用于轉染植物的方法和用于在植物中表達RNA或多肽分子的方法。特別地，轉染具有降低的POLQ表達和/或活性的植物以減少隨機整合事件。本公開還提供了通過本文公開的方法產生的轉染植物和植物后代。

發明領域

本公開提供了用于轉染植物的方法和在植物中表達RNA或多肽分子的方法。特別地，轉染具有降低的POLQ表達和/或活性的植物以減少隨機整合事件。本公開還提供了通過本文公開的方法產生的轉染植物和植物后代。

發明背景

通過轉染對植物進行基因改造允許改變性狀，例如增加產量，抗病蟲害，增加營養生物量，除草劑耐受性，營養質量，干旱和脅迫耐受性，以及園藝品質如色素形成和生長，以及作物改良的其他農藝特性。此外，基因修飾的植物已被用作表達重組蛋白的系統。

用核酸轉染植物如今是一種常見的做法，其可以通過本領域已知的許多不同方法來進行。然而，現有轉染方法的一個缺點是在宿主基因組中產生相對大量的隨機DNA整合事件。隨機整合可對宿主生物體產生不可預測和/或有害的影響。此外，將DNA整合到植物基因組中并不總是可取的，特別是當基因改造(GMO)的植物引起環境和政治問題時。因此，仍然需要開發用于植物中表達轉基因的改良系統。

發明簡述

本公開一方面提供了用于減少轉染的核酸分子在植物細胞中隨機整合的方法，所述方法包括向植物細胞提供核酸分子，其中所述植物細胞中的POLQ表達和/或活性降低。

本公開另一方面提供了用核酸分子轉染植物細胞的方法，所述方法包括向植物細胞提供核酸分子，其中所述植物細胞中的POLQ表達和/或活性降低。

在優選的實施方案中，所述方法用于基因打靶。具體地，所述方法用于通過基因重組產生在其基因組中的特定位點攜帶DNA序列的植物細胞。

本公開另一方面提供了用于在植物細胞中表達RNA分子或多肽的方法，所述方法包括向植物細胞提供編碼所述RNA分子或多肽的核酸分子，其中所述宿主細胞中的POLQ表達和/或活性降低。

本公開另一方面提供了用于產生表達RNA分子或多肽的植物的方法，所述方法包括向植物細胞提供編碼所述RNA分子或多肽的核酸分子，以及由所述植物細胞產生植物，其中所述植物細胞中的POLQ表達和/或活性降低。

優選地，將核酸分子轉染到具有降低的PolQ表達和/或活性的植物細胞中。在一些實施方案中，將核酸分子瞬時轉染到植物細胞中。優選地，核酸包含植物表達盒。優選地，植物表達盒包含編碼多肽或RNA分子的核酸序列和驅動表達的調控序列。優選地，核酸是核酸酶。優選地，核酸是Crispr/Cas系統組分。

在一些實施方案中，核酸分子通過基因重組在特定位點整合到植物細胞的染色體(或者更確切地說，通過位點特異性基因重組或同源重組)。優選地，這種穩定整合導致異源多肽或RNA分子的表達。在一些實施方案中，整合是同源重組的結果。在一些實施方案中，這種穩定整合破壞或修飾內源基因。在一些實施方案中，整合是位點特異性重組的結果。

在一些實施方案中，所述植物細胞包含對由POLQ基因編碼的前mRNA具有特異性的反義寡核苷酸，或對由POLQ基因編碼的mRNA具有特異性的雙鏈RNAi分子。在一些實施方案中，植物細胞具有突變的POLQ基因。在一些實施方案中，植物細胞具有POLQ基因的敲除。

本公開另一方面提供了通過本文公開的方法產生的植物及其后代(包括種子)。優選地，所述植物和后代包含通過基因重組(即，位點特異性整合和非隨機整合)穩定整合到基因組的核酸分子。

在上述的一些實施方案中，所述植物細胞不是擬南芥的。

本公開另一方面提供了植物或植物細胞，其中所述植物或植物細胞中的POLQ表達和/或活性降低，并且其中所述植物或植物細胞不是擬南芥的。本公開還提供了所述植物和細胞用于轉染核酸分子的用途。