[發明專利]將物質導入植物的方法

有效

• 申請號: 201780018863.3
• 申請日: 2017-03-28
• 公開（公告）號: CN109310061B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 加藤紀夫;岡本龍史;木羽隆敏;戶田繪梨香
• 申請（專利權）人: 株式會社鐘化;公立大學法人首都大學東京;國立研究開發法人理化學研究所
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 沈雪

本發明涉及將物質導入植物的方法。本發明的方法包括以下工序：(1?i)從包含植物的受精卵細胞的組織中分離受精卵細胞，然后，用含有植物組織分解酶的酶溶液對該受精卵細胞進行低效價條件處理；(1?ii)用含有植物組織分解酶的酶溶液對包含植物的受精卵細胞的組織進行低效價條件處理，接著，將經過酶處理的受精卵細胞分離；(1?iii)用含有植物組織分解酶的酶溶液對包含植物的受精卵細胞的組織進行低效價條件處理，同時將經過酶處理的受精卵細胞分離；(1?iv)從植物體中分離卵細胞及精細胞，使它們融合，從而制備受精卵，然后，用含有植物組織分解酶的酶溶液對該受精卵細胞進行低效價條件處理；或者，(1?v)用含有植物組織分解酶的酶溶液對包含植物的卵細胞的組織進行低效價條件處理，接著，將經過酶處理的卵細胞分離，并進一步使其與分離后的精細胞融合；通過上述(1?i)～(1?v)獲得經過酶處理的分離受精卵細胞，然后進行下述(2)，(2)將選自核酸、蛋白質及肽的物質導入得到的經過酶處理的分離受精卵細胞。

技術領域

本發明涉及將物質導入植物的方法。

背景技術

對于植物、特別是單子葉植物的基因重組技術而言，以20世紀90年代在稻、玉米中開發了利用土壤桿菌的方法為契機，其應用快速普及，目前為止已開發出了各種轉化方法。然而，已知其中多數需要經由植物組織的脫分化和再分化，因此在物種、品種之間轉化的效率有很大不同。根據物種、品種的不同，轉化效率低，無法得到具有重現性的轉化植物。例如，對于在玉米中育種上非常重要的系統B73而言，尚未開發出具有重現性的轉化法。

另外，近年來高效地進行基因組編輯逐漸成為可能，但由于根據作物種類、品種的不同，組織培養的容易性不同，這一點對于基因組編輯效率有很大的影響，因此妨礙了植物中的基因組編輯的實用化。

另一方面，在20世紀90年代，嘗試了從植物體分離精細胞和卵細胞并使它們人工融合的人工受精，成功地制備了植物體。非專利文獻1中記載了使玉米的卵細胞及精細胞進行電融合而制備受精卵細胞，并將其培養為植物體的方法。非專利文獻1中在卵細胞的分離中使用了酶的混合物(0.75％果膠酶(pectinase(Serva))、0.25％pectolyase、0.5％半纖維素、0.5％纖維素酶)，但使用的酶、特別是果膠酶(pectinase)的效價高。而且，也沒有記載使用利用該卵細胞制成的受精卵細胞進行基因導入、轉化的內容。

另外，非專利文獻2中記載了稻的雌雄配偶子(卵細胞和中央細胞)的分離方法。具體而言，從植物體分離胚珠后，在0.3M甘露醇溶液中進行了酶處理(用甘露醇溶液(650mosmol/kg·H₂O)+0.3％Pectolyase Y-23、1.5％果膠酶、1％纖維素、1％半纖維素處理10～15分鐘)，但與非專利文獻1一樣，酶、特別是果膠酶的效價高。另外，對象不是受精卵而是受精前卵細胞，對于再生為植物、進行對植物的基因導入、轉化的內容也沒有記載。

非專利文獻3及非專利文獻4中記載了通過稻的雌雄配子的電融合而制備受精卵、并將其培養成植物體的方法。這些現有文獻中示出了從使雌雄配子人工融合而成的受精卵細胞誘導為植物體的可能性。然而，在上述文獻中，與非專利文獻2同樣地對于基因導入、轉化方面完全沒有記載，能否使用受精卵進行轉化仍然完全不明確。需要說明的是，非專利文獻3及4中也沒有記載對卵細胞進行酶處理。

對于玉米(非專利文獻5、12)、稻(非專利文獻6、11)、小麥(非專利文獻7)、大麥(非專利文獻8、10)、煙草(非專利文獻9)等物種而言，已知有從受精后的胚囊采集、培養受精卵、并制備植物體的例子。其中，有如非專利文獻5、10那樣表明了能夠通過顯微注射法將DNA導入受精卵細胞的報告，但沒有該方法已經實用化的情況的報告。另外，也完全沒有利用其它方法進行基因導入的見解。