[發(fā)明專利]合成測序中的多酚添加劑

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780018264.1
• 申請日: 2017-02-08
• 公開（公告）號: CN109196113B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發(fā)明（設計）人: J·奧列尼爾;M·G·珀伯斯特
• 申請（專利權）人: 奇根科學有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;A61K31/404;G01N33/52
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 唐宏

本發(fā)明涉及如所述的方法、組合物、裝置、系統(tǒng)和試劑盒，其包含但不限于用于使用例如合成測序方法確定核苷酸序列中核酸的身份的試劑和混合物。特別地，本發(fā)明考慮使用被稱為抗氧化添加劑的多酚化合物來提高合成測序反應的效率。例如，沒食子酸(GA)在本文中顯示為許多示例性SBS多酚添加劑之一。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及如所述的方法、組合物、裝置、系統(tǒng)和試劑盒，其包含但不限于用于使用例如合成測序方法確定核苷酸序列中核酸的身份的試劑和混合物。特別地，本發(fā)明考慮使用被稱為抗氧化添加劑的多酚化合物來提高合成測序反應的效率。例如，沒食子酸(GA)在本文中顯示為許多示例性SBS多酚添加劑之一。

背景

在過去的25年中，已生成并存入Genbank的DNA序列信息量呈指數增長。傳統(tǒng)的測序方法(例如，Sanger測序)正在被使用合成測序形式(SBS)的新一代測序技術所取代，其中使用特殊設計的核苷酸和DNA聚合酶來以受控方式讀取芯片結合的單鏈DNA模板的序列。為了獲得高通量，在測序芯片上排列了數百萬個這樣的模板斑點，并且獨立地讀出和記錄它們的序列。

使用陣列進行DNA測序的系統(tǒng)是已知的(例如，Ju等人，美國專利號6,664,079)。然而，仍然需要用于提高核酸序列測序的準確性和/或效率以及增加可用于自動測序的閱讀長度的方法和組合物。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及如所述的方法、組合物、裝置、系統(tǒng)和試劑盒，其包含但不限于用于使用例如合成測序方法確定核苷酸序列中核酸的身份的試劑和混合物。特別地，本發(fā)明考慮使用被稱為抗氧化添加劑的多酚化合物來提高合成測序反應的效率。例如，沒食子酸(GA)在本文中顯示為許多示例性SBS多酚添加劑之一。

在一個實施方案中，本發(fā)明考慮在合成測序(SBS)的裂解步驟期間使用多酚化合物作為裂解試劑的抗氧化添加劑。這種應用方法導致測序性能的顯著改善(原始錯誤率因此支持更長的讀長)。這種效果可能是由于通過清除自由基副產物和過量裂解試劑的失活來提高裂解反應的效力。這種自由基副產物可能在流動池中積聚，導致進入隨后的延伸步驟，從而導致3'-OH部分的過早去保護并損害單堿摻入率。

在一個實施方案中，本發(fā)明考慮了摻入經標記的核苷酸的方法，包括：a)提供i)多個核酸引物和模板分子，ii)聚合酶，iii)包含還原劑和多酚的裂解試劑化合物，和iv)多個核苷酸類似物，其中至少一部分所述核苷酸類似物用通過可裂解接頭(例如二硫化物接頭)連接到堿基上的標記物標記；b)將至少一部分所述引物與至少一部分所述模板分子雜交，以產生雜交的引物；c)將第一經標記的核苷酸類似物與所述聚合酶摻入到至少一部分所述雜交的引物中，以產生包含摻入的經標記的核苷酸類似物的延伸引物；d)檢測所述摻入的經標記的核苷酸類似物；e)用所述裂解試劑裂解所述摻入的核苷酸類似物的可裂解接頭。在一個實施方案中，多酚化合物選自沒食子酸，龍膽酸，鄰苯二酚，鄰苯三酚，對苯二酚和/或間苯二酚(或其組合)。在一個實施方案中，所述裂解試劑的所述還原劑包含TCEP(三(2-羧乙基)膦)。在一個實施方案中，步驟c)的所述摻入的核苷酸類似物還包含封閉3'-OH基團的可去除的化學部分。在一個實施方案中，步驟e)的裂解去除了封閉3'-OH基團的可去除的化學部分。在一個實施方案中，該方法還包括f)將第二核苷酸類似物與所述聚合酶摻入到至少一部分所述延伸引物中。

不意欲本發(fā)明限于標記物的類型?？紤]了各種標記物。在優(yōu)選的實施方案中，所述標記物是發(fā)熒光的。

本發(fā)明還涉及組合物和試劑。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及裂解試劑，其包含i)還原劑，和ii)多酚化合物。在一個實施方案中，多酚化合物包括但不限于沒食子酸，龍膽酸，鄰苯二酚，鄰苯三酚，對苯二酚和/或間苯二酚。在一個實施方案中，所述還原劑是TCEP(三(2-羧乙基)膦)。