[發(fā)明專利]多項(xiàng)擴(kuò)增法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201780017193.3
• 申請(qǐng)日: 2017-04-19
• 公開（公告）號(hào): CN108779453A
• 公開（公告）日: 2018-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 山口正裕;蔵田信也
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 日鐵住金環(huán)境株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12N15/09
• 分類號(hào): C12N15/09;C12Q1/6844
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 曹陽

本發(fā)明提供一種技術(shù)，在使用下一代測(cè)序儀主要以多個(gè)基因作為目標(biāo)的情況下，用于有效地均勻地附加測(cè)定所必需的人工核酸序列。本發(fā)明提供一種方法，該方法使用由包含至少1對(duì)以上的包含正向引物(a)和反向引物(b)的引物對(duì)的引物對(duì)組X、包含正向引物(c)和反向引物(d)的引物對(duì)Y、以及包含正向引物(e)和反向引物(f)的引物對(duì)Z構(gòu)成的引物組，同時(shí)地?cái)U(kuò)增多個(gè)目標(biāo)核酸組，所述正向引物(a)在3’末端側(cè)具有與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列，在其上游側(cè)具有人工核酸序列A的全部或3’末端側(cè)的一部分序列，所述反向引物(b)在3’末端側(cè)具有與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列，在其上游側(cè)具有人工核酸序列B的全部或3’末端側(cè)的一部分序列，所述正向引物(c)在3’末端側(cè)具有人工核酸序列A，在5’末端側(cè)具有人工核酸序列C，所述反向引物(d)在3’末端側(cè)具有人工核酸序列B，在5’末端側(cè)具有人工核酸序列D，所述正向引物(e)具有人工核酸序列C的全部或一部分序列，所述反向引物(f)具有人工核酸序列D的全部或一部分序列。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明主要涉及進(jìn)行特定的核酸序列組的檢測(cè)或序列確定的分析。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供向作為目標(biāo)的核酸序列附加包含用于識(shí)別樣品的作為人工核酸序列的條形碼序列(バーコード配列)的1個(gè)以上的人工設(shè)計(jì)的核酸序列(以下稱作人工核酸序列)的擴(kuò)增方法。

背景技術(shù)

在醫(yī)療中的基因診斷、食品中的衛(wèi)生檢查、環(huán)境中的監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域中，使用檢測(cè)特定的核酸序列的操作。

而且，近年來由于下一代測(cè)序儀興起，與以往方法的測(cè)序法相比核酸序列確定變得相當(dāng)容易，因此作為新的分析方法顯現(xiàn)出流行的趨勢(shì)。

在下一代測(cè)序儀中，為了提供來自于多個(gè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的混合物，必須在想要進(jìn)行序列確定的核酸片段的兩個(gè)末端附加包含用于識(shí)別樣品的條形碼序列的特定的人工核酸序列，在擴(kuò)增作為目標(biāo)的核酸序列的步驟以外，還需要用于該目的的核酸擴(kuò)增反應(yīng)步驟。

即使使用在對(duì)于作為目標(biāo)的核酸序列而言特異性引物的5’末端側(cè)預(yù)先附加有包含條形碼序列的特定的人工核酸序列的引物，也可以得到提供給下一代測(cè)序儀的核酸片段，然而必須依照核酸序列的種類以樣品的個(gè)數(shù)準(zhǔn)備條形碼序列不同的引物，極為不經(jīng)濟(jì)。為此，希望有將由不同于特異性引物的、僅由人工核酸序列構(gòu)成的引物用于擴(kuò)增，在擴(kuò)增的過程中共同地附加于各個(gè)核酸序列的方法。

另外，在作為目標(biāo)的核酸為多種的情況下，經(jīng)常使用多重PCR，然而容易在各目標(biāo)核酸的擴(kuò)增效率方面產(chǎn)生波動(dòng)，對(duì)于引物設(shè)計(jì)要求高度的技術(shù)。

作為為了抑制擴(kuò)增效率的波動(dòng)、并且用于獲得附加有人工核酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，報(bào)告過使用了在3’末端側(cè)具有人工核酸序列的引物、及使用了將該人工核酸序列的全部或3’末端側(cè)的一部分附加于特異性序列的5’末端側(cè)的引物的擴(kuò)增反應(yīng)方法(專利文獻(xiàn)1、2)。

根據(jù)專利文獻(xiàn)1、2，通過使具有特異性序列的引物的濃度低于由附加有人工核酸序列的核酸構(gòu)成的引物(以下稱作人工核酸引物)的濃度，共同地附加于全部目標(biāo)序列的人工核酸引物就可以支配性地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增效率的波動(dòng)得到抑制。

但是，在使用專利文獻(xiàn)1、2的方法制備用于提供給下一代測(cè)序儀的核酸序列的情況下，由于以高濃度使用的人工核酸引物為約60～70堿基，形成長(zhǎng)鏈，因此產(chǎn)生引物二聚體的可能性提高。特別是在作為目標(biāo)的核酸序列為多個(gè)的情況下，由于所用的特異性引物的種類增加，因此會(huì)高頻率地產(chǎn)生引物二聚體。由此，在下一代測(cè)序儀分析時(shí)會(huì)帶來目標(biāo)序列以外的序列信息增多的問題。

此外，一旦作為目標(biāo)的核酸序列的種類增加，所用的特異性引物的總量就會(huì)增加，其結(jié)果是，人工核酸引物無法支配性地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，會(huì)有沒有附加人工核酸序列的核酸序列的比例變高的問題。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：WO2006/023919

專利文獻(xiàn)2：日本特表2012－522517

發(fā)明內(nèi)容