[發(fā)明專利]多項(xiàng)擴(kuò)增法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201780017193.3
• 申請(qǐng)日: 2017-04-19
• 公開（公告）號(hào): CN108779453A
• 公開（公告）日: 2018-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 山口正裕;蔵田信也
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 日鐵住金環(huán)境株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12N15/09
• 分類號(hào): C12N15/09;C12Q1/6844
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 曹陽(yáng)

1.一種方法，該方法使用由包含至少1對(duì)以上的包含正向引物(a)和反向引物(b)的引物對(duì)的引物對(duì)組X、包含正向引物(c)和反向引物(d)的引物對(duì)Y、以及包含正向引物(e)和反向引物(f)的引物對(duì)Z構(gòu)成的引物組，同時(shí)地?cái)U(kuò)增多個(gè)目標(biāo)核酸組，

所述正向引物(a)在3’末端側(cè)具有與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列，在其上游側(cè)具有人工核酸序列A的全部或3’末端側(cè)的一部分序列，所述反向引物(b)在3’末端側(cè)具有與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的序列，在其上游側(cè)具有人工核酸序列B的全部或3’末端側(cè)的一部分序列，

所述正向引物(c)在3’末端側(cè)具有人工核酸序列A，在5’末端側(cè)具有人工核酸序列C，所述反向引物(d)在3’末端側(cè)具有人工核酸序列B，在5’末端側(cè)具有人工核酸序列D，

所述正向引物(e)具有人工核酸序列C的全部或一部分序列，所述反向引物(f)具有人工核酸序列D的全部或一部分序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，

所述引物對(duì)Y的正向引物(c)和反向引物(d)分別在人工核酸序列C、D的3’末端與人工核酸序列A、B的5’末端之間具有用于識(shí)別樣品的人工核酸序列，即以下的條形碼序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，

最先將所述的引物對(duì)組X及引物對(duì)Y、Z全都混合，不進(jìn)行中途的純化、稀釋地利用一連串的反應(yīng)完成所述擴(kuò)增。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，

在試樣溶液中，所述引物對(duì)Z以所述引物對(duì)Y的濃度的至少3倍存在。

5.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，

在試樣溶液中，所述引物對(duì)Y以不產(chǎn)生來自于它的引物二聚體的濃度存在，并且所述引物對(duì)Z以足以獲得目的產(chǎn)物的濃度存在。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，

所述引物對(duì)組X包含至少5對(duì)引物。

7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，

所述引物對(duì)組X包含至少20對(duì)引物。

8.根據(jù)權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，

在試樣溶液中，所述引物對(duì)組X中的各引物對(duì)以1nM～20nM的范圍存在。

9.根據(jù)權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，

在試樣溶液中，通過調(diào)整所述引物對(duì)組X中的各引物對(duì)的濃度，可以使各目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率接近均勻。

10.根據(jù)權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，

所述擴(kuò)增是PCR法、LAMP法、NASBA法、ICAN法、LCR法、滾環(huán)法SMAP法、PALSAR法的任意1種。

11.根據(jù)權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，

進(jìn)行2個(gè)循環(huán)以上的利用所述引物對(duì)組X的擴(kuò)增，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)以上的利用所述引物對(duì)Y、Z的擴(kuò)增。

12.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，

使用具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶進(jìn)行所述擴(kuò)增。