[發(fā)明專利]靶分析物的亞細胞定位

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780016884.1
• 申請日: 2017-03-16
• 公開（公告）號: CN108780086B
• 公開（公告）日: 2023-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 喬治·布里坦;謝爾蓋·古爾尼克
• 申請（專利權(quán)）人: 貝克曼考爾特公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 上海華誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31300
• 代理人: 湯國華

本發(fā)明提供了通過使用至少兩種透化試劑來確定和定量細胞樣品中分析物的亞細胞定位的方法。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求提交于2016年3月18日的美國臨時申請No.62/310,595的優(yōu)先權(quán)，該臨時申請的內(nèi)容全文以引用方式并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于細胞樣品中靶分析物的亞細胞檢測和分析的方法、制品和組合物。

背景技術(shù)

通過流式細胞術(shù)對細胞內(nèi)標記物的分析依賴于每個細胞內(nèi)存在的每種染色或熒光標記物所發(fā)射的絕對信號的測量。這些數(shù)據(jù)不賦予此類信號的亞細胞定位，并且使用戶通過染色或靶分子(如果有的話)的現(xiàn)有知識來推斷定位。例如，當分析可活化蛋白質(zhì)(諸如轉(zhuǎn)錄因子)的活化時，傳統(tǒng)流式細胞術(shù)唯一存在的方法是分析其磷酸化或其他修飾的水平，并且假設(shè)該信息與最終的核定位相關(guān)。

分析這些分子中的任一個時的重要因素是它們是否實際存在或轉(zhuǎn)位到細胞核中。在一些情況下，諸如對于信號轉(zhuǎn)導子及轉(zhuǎn)錄活化子(STAT)家族的成員，該信息可能是相當準確的，因為STAT一旦磷酸化便立即轉(zhuǎn)位到細胞核中。然而，情況并非總是如此，因為細胞信號傳導通常非常復雜，并且大多數(shù)蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)位到細胞核中之前需要一組迂回事件。還可能需要附加活化步驟以在細胞核內(nèi)啟動一次轉(zhuǎn)錄修飾。

另外，任何僅依賴于修飾狀態(tài)而沒有關(guān)于亞細胞定位的信息的方法受到各種問題的阻礙，包括：1)對此類修飾有用的抗體的必要性；2)事實上，對于每一種蛋白質(zhì)/分子存在許多不同類型的修飾，所述修飾都需要它們自身可能不存在的抗體(例如，磷酸化、氨基甲酰化、甲基化，乙酰化、磺化、亞硝基化、遍在蛋白化等)；3)事實上，對于大多數(shù)蛋白質(zhì)/分子實際上并未識別大多數(shù)修飾；4)修飾狀態(tài)的短暫性質(zhì)，這不一定直接與蛋白質(zhì)隨時間推移的亞細胞定位或與蛋白質(zhì)表達水平本身相關(guān)(即，不再被修飾的蛋白質(zhì)仍可存在并且在靶區(qū)室內(nèi)起作用)；5)用于評估此類修飾的透化試劑盒的兼容性；6)以及要求被分析的分子表面上存在修飾或此類修飾的生物化學暴露，以便使抗體能夠接近染色的修飾。實際上，雖然磷酸化與STAT家族的核轉(zhuǎn)位的誘導完全相關(guān)，但后者的問題使得除了市場上最苛刻的固定/透化試劑盒之外的所有試劑盒都無法評估STAT磷酸化，這通常由于其苛刻性而對檢測其他蛋白質(zhì)有問題。

通過使用細胞通過細胞儀時的低至中等分辨率顯微鏡圖像，成像流式細胞術(shù)已被用于視覺評估蛋白質(zhì)的亞細胞定位。作為另外一種選擇，細胞已被純化，然后通過傳統(tǒng)顯微鏡檢查、生物化學細胞亞分級分離后蛋白質(zhì)溶解物的蛋白質(zhì)印跡、或其他分子生物化學方法進行分析。

這些現(xiàn)有技術(shù)方法都有缺點。成像流式細胞術(shù)需要昂貴的儀器。它也主要是定性的，并且因為它拍攝三維細胞的二維圖像，所以可能無法有效區(qū)分位于圖像中的細胞核前面或后面的區(qū)室內(nèi)的核周蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的細胞質(zhì)與核定位。類似地，傳統(tǒng)顯微鏡工作良好，但主要是定性的并且難以解析核周蛋白質(zhì)的三維定位。更先進的顯微技術(shù)(諸如共焦顯微鏡)主要通過拍攝細胞的許多圖像切片來解決該問題，然后允許將它們重建成三維圖像；然而，這些顯微鏡比圖像細胞儀昂貴得多，并且它們與粘附到顯微鏡載片的細胞一起工作效果最佳。此外，即使用最先進的顯微鏡，仍然難以辨別核周膜結(jié)合蛋白質(zhì)是位于核膜內(nèi)部還是外部。

分子生物化學技術(shù)的主要缺點是處理和制備蛋白質(zhì)提取物以供分析所需的時間和精力，對于大多數(shù)技術(shù)(包括蛋白質(zhì)印跡)這可能花費數(shù)天。此外，顯微鏡和分子生物化學技術(shù)在用于分析復雜樣品(諸如全血)時共同的主要缺點是必須首先純化靶細胞群，然后在進一步的實驗和分析之前休息、培養(yǎng)并且可能擴增細胞持續(xù)數(shù)天至數(shù)周。

本發(fā)明解決了用于檢測靶分析物(諸如可活化蛋白質(zhì))的亞細胞定位的現(xiàn)有技術(shù)方法的這些和其他缺點。

發(fā)明內(nèi)容