[發明專利]昆蟲細胞中的AAV產生、其方法和組合物

在審

• 申請號: 201780010098.0
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN108699567A
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 陳海峰
• 申請（專利權）人: 威洛克有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N7/01;C12N7/00;C12N5/10
• 代理公司: 北京市鑄成律師事務所 11313
• 代理人: 郗名悅;屈小春

公開了用于在體外在昆蟲細胞中產生腺相關病毒(AAV)的組合物和方法。重組桿狀病毒載體包含AAV衣殼蛋白基因表達盒(Cap)、AAV Rep基因表達盒(Rep)和桿狀病毒同源區(hr)，所述桿狀病毒同源區位于距離AAV表達盒中的起始密碼子高達約4kb處。與包含Cap和Rep但沒有hr的對照相比，攜帶包含Cap、Rep和hr的重組桿狀病毒的昆蟲細胞中桿狀病毒和AAV的產生水平更高。此外，在用包含Cap、Rep和hr的重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞中，桿狀病毒和AAV產生的水平在細胞連續傳代中相對穩定，而在包含含有Cap和Rep但沒有hr的重組桿狀病毒的昆蟲細胞的連續傳代中，桿狀病毒和AAV產生的水平下降。

對現有申請案的引用

本申請要求2016年4月21日提交的美國臨時申請62/325,817的權益和優先權。申請62/325,817以引用的方式整體并入本文。

通過引用并入序列表的

序列表是本公開的一部分，包括計算機可讀形式和包含核苷酸和/或氨基酸序列的書面序列表。以計算機可讀形式記錄的序列表信息與書面序列表相同。序列表的主題以引用的方式整體并入本文

引言

隨著第一種腺相關病毒(AAV)介導的基因治療藥物的批準，對大規模AAV載體制造技術的需求不斷增加(S.,Mol.Ther.20,1831-1832,2012)。目前有幾種生產AAV的技術。傳統方法利用三重質粒或雙重質粒轉染HEK293細胞或其他哺乳動物細胞系。該方法的AAV產率低，并且由于其對貼壁細胞的需要而難以擴大規模(Xiao,X.,Li,J.&Samulski,R.J.,J.Virol.72,2224-2232,1998)。另一種生產AAV的方法利用單純皰疹病毒(HSV)感染哺乳動物細胞。該方法受到產生足夠的HSV種子儲備的困難的阻礙，并且還具有低AAV生產力(Booth,M.J.等,Gene Ther.11,829-837,2004)。

與其他系統相比，用于昆蟲細胞中AAV載體產生的基于桿狀病毒的方法具有顯著增加的AAV產生產率(Urabe,M.等,Human Gene Therapy 13,1935-1943,2001；Chen,H.,Mol.Ther.16,924-930,2008；Chen,H.,Molecular Therapy–Nucleic Acids 1,e57,2012；Chen的美國專利8,945,918)。然而，重組桿狀病毒在多次傳代中會不穩定，導致AAV產生下降。因此，對AAV生產系統存在未滿足的需求，該AAV生產系統在多次傳代后也能夠維持以高產率產生AAV載體。

桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)多核多角體病毒(AcMNPV)基因組包含稱為hr1-hr5的5個“同源區”(hr)(Cochran,M.A.和Faulkner,P.,J.Virol.45,961-970,1983；Guarino,L.A.和Summers,M.D.,J.Virol.60,214-223,1986)。這5個區域可以起增強子的作用(Guarino,L.A.等,J.Virol.60,224-229,1986)。已經報道了hr1-hr5的序列(Guarino,L.A.和Summers,M.D.,J.Virol.60,214-223,1986；Guarino,L.A.等,J.Virol.60,224-229,1986)并且在本文中闡述。hr的長度可以是從約400個堿基對至高達約1,000個堿基對。AcMNPV hr序列的實例如下。