[發明專利]用于純化纖維蛋白原的方法

有效

• 申請號: 201780006426.X
• 申請日: 2017-01-12
• 公開（公告）號: CN109071596B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發明（設計）人: 金俊植;金孝珍;樸芝允;李柱浩;孫載云;辛庸源
• 申請（專利權）人: 株式會社綠十字控股
• 主分類號: C07K1/30
• 分類號: C07K1/30;C07K1/34;C07K1/36;B01J20/08;C07K14/75;A61K38/36
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 陳桉

本發明涉及一種用于純化纖維蛋白原的方法，并且更具體地，涉及一種包括以下步驟的用于純化纖維蛋白原的方法：(a)(第一甘氨酸沉淀)通過向其中添加甘氨酸直到甘氨酸濃度變為1.5?2.5M，使在含有纖維蛋白原的溶液中含有的所述纖維蛋白原沉淀，去除上清液，然后獲得沉淀物；(b)(第二甘氨酸沉淀)，通過在裂解緩沖液中裂解由步驟(a)中的第一甘氨酸沉淀獲得的沉淀物而獲得裂解溶液，通過向其中添加甘氨酸直到甘氨酸濃度變為0.2?1.2M使所述裂解溶液沉淀，并且回收上清液；(c)(第三甘氨酸沉淀)通過向其中添加甘氨酸直到甘氨酸濃度變為1.5?2.5M使步驟(b)的上清液沉淀，并且獲得沉淀物；和(d)，通過在裂解緩沖液中裂解步驟(c)的沉淀物獲得裂解溶液，和通過納米過濾器在其上進行納米過濾(NF)。根據本發明，用于純化纖維蛋白原蛋白的新的方法，因為病原性的動物來源的組分(病毒)的流入基本被攔截而是一種非常安全的方法，因為可通過簡單的方法純化具有高產率的高純度纖維蛋白原蛋白而是非常經濟和有效的，并且因為與常規方法純化的纖維蛋白原相比具有通過具有高純度而增加局部作用的優點，而可以用于預防和治療血液相關疾病，特別是血液凝固病癥。

技術領域

本發明涉及一種用于純化纖維蛋白原的方法，并且更具體地，涉及一種包括以下步驟的用于純化纖維蛋白原的方法：(a)通過將甘氨酸添加到含有纖維蛋白原的溶液中使甘氨酸的濃度為1.5至2.5M而使該溶液中的纖維蛋白原沉淀，然后去除上清液，并回收沉淀物(第一甘氨酸沉淀)；(b)使步驟(a) 的第一甘氨酸沉淀的沉淀物溶解于溶解緩沖液中以獲得溶液，通過向其中添加甘氨酸使甘氨酸濃度為0.2至1.2M而使所述溶液沉淀，和回收上清液(第二甘氨酸沉淀)；(c)通過向其中添加甘氨酸使甘氨酸濃度為1.5至2.5M而使步驟(b)的上清液沉淀，和回收沉淀(第三甘氨酸沉淀)；和(d)使步驟(c)的沉淀溶解于溶液緩沖液以獲得溶液，并使用納米過濾器使所述溶液經受納米過濾(NF)。

背景技術

纖維蛋白原，也稱為凝血因子I，在止血和傷口愈合中起關鍵作用。它是在肝臟中合成的糖蛋白，具有340kDa的表觀分子量，并且由兩個二聚體組成，兩個二聚體中的每個由通過二硫橋連接的稱為Aα、Bβ和γ的三對不相同多肽鏈構成。它以約150-400μg/ml的濃度在血流中循環。在血管損傷時，血小板被激活并形成栓。纖維蛋白原通過幫助交聯活化的血小板而參與初期止血。

與此同時，開始凝血級聯的活化。作為終點，通過藉由凝血酶蛋白水解釋放纖維蛋白肽A和以更低速率蛋白水解釋放纖維蛋白肽B，使纖維蛋白原轉化為纖維蛋白。將可溶纖維蛋白單體裝配成雙鏈扭曲的纖絲。隨后，這些纖絲以橫向方式排列，產生更粗的纖維。然后通過FXIIIa使這些纖維交聯成纖維蛋白網絡，其通過纖維蛋白與活化的血小板的相互作用穩定了血小板栓，產生穩定的凝塊。

病癥和缺乏

先天性無纖維蛋白原血癥是一種罕見的出血病癥，其中，患者由于纖維蛋白原的缺乏或功能失常而患有血液凝固不足。該病癥可導致自發出血或在小的創傷后或在介入性程序過程中過度出血。

纖維蛋白原的獲得性缺陷比先天性無纖維蛋白原血癥更常見，并且可由血稀釋或其他事件諸如手術、創傷、彌散性血管內凝血(DIC)或膿毒癥過程中的失血誘導。

可以通過替代療法靜脈輸注新鮮冷凍血漿或低溫沉淀物，而將纖維蛋白原缺乏校正到血漿中約1.5-3g/l的正常纖維蛋白原水平。然而，這些治療有將病原體例如病毒或朊病毒引入患者的風險，并且因此導致另外的病癥。因此建議經過靜脈應用病毒失活的纖維蛋白原組合物以安全的方式恢復生理水平的纖維蛋白原。

纖維蛋白原純化

人血漿含有超過100種蛋白質的復雜混合物，纖維蛋白原占蛋白質總量的約2％。因此，纖維蛋白原的純化和分離通常需要多個步驟，并且這些單獨過程步驟的多種組合是可能的。