[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用紫外分光光度法測(cè)定殼聚糖酸水解率的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711500093.4
• 申請(qǐng)日: 2017-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108254328A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 白研;蘇政權(quán);毋福海
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣東藥科大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/33
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/33
• 代理公司: 廣州勝沃園專(zhuān)利代理有限公司 44416
• 代理人: 孫文卉

本發(fā)明涉及一種利用紫外分光光度法測(cè)定殼聚糖酸水解率的方法，屬于大分子水解技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以殼聚糖水解液中GAH的產(chǎn)率為指標(biāo)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的環(huán)境下對(duì)殼聚糖水解條件進(jìn)行優(yōu)化，將采用乙酰丙酮法對(duì)水解條件進(jìn)行篩選，優(yōu)選最佳水解條件，并對(duì)殼聚糖水解生成產(chǎn)物氨基葡萄糖進(jìn)行了驗(yàn)證，用紫外分光光度法測(cè)定氨基葡萄糖的含量。本發(fā)明具有成本低、工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高的特點(diǎn)，具有產(chǎn)業(yè)化的前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用紫外分光光度法測(cè)定殼聚糖酸水解率的方法，屬于大分子水解技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甲殼素(chitin)是蝦、蟹等甲殼類(lèi)、甲蟲(chóng)等的外骨骼及蘑菇等菌類(lèi)的細(xì)胞壁成分，廣泛存在于自然界。殼聚糖(chitosan)是甲殼素脫去乙酰基的產(chǎn)物，是一種為數(shù)不多的、天然的、商品化的堿性多糖，其資源量?jī)H次于纖維素。由于殼聚糖具有良好的成膜性、生物可降解性和一定的抗菌消炎及促進(jìn)傷口愈合作用，在紡織、印染、造紙、食品、醫(yī)藥、環(huán)保等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在醫(yī)療方面，可制作外科手術(shù)線(xiàn)，人造血管和人造皮膚，止血海綿及創(chuàng)傷專(zhuān)用敷料；在藥物制劑方面，可做緩釋藥物及抗癌藥物等。另外殼聚糖還具有促進(jìn)人體腸內(nèi)雙歧桿菌的生長(zhǎng)、防止人體膽固醇的蓄積，促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫等功能。

D-氨基葡萄糖鹽酸鹽又稱(chēng)葡萄糖胺鹽酸鹽(D-Glucosamine Hydrochloride，GAH)，是殼聚糖水解的最終產(chǎn)物。GAH在體內(nèi)具有重要的生理意義：參與肝腎解毒，發(fā)揮抗炎、護(hù)肝、抗反應(yīng)性、抗低氧的作用；刺激嬰兒腸道中雙歧桿菌的增生等。D-氨基葡萄糖的用途十分廣泛，具有巨大的科學(xué)價(jià)值、社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)利益，國(guó)內(nèi)外需求正日益增加。目前，GAH大多數(shù)以甲殼素或殼聚糖為原料制備，但由于在敞開(kāi)式水解過(guò)程中，殼聚糖分子間與分子內(nèi)部的氫鍵斷裂后會(huì)被空氣中的氧氣破壞而影響顯色反應(yīng)，測(cè)定值偏低，回收率30％～40％。又由于酸水解過(guò)程中采用單一酸進(jìn)行水解。酸的濃度不高，普遍需要長(zhǎng)時(shí)間水解才能得到較高的水解產(chǎn)率，水解效率低。GAH含量測(cè)定方法有很多，在殼聚糖測(cè)定中常用的測(cè)定還原糖的方法主要有高效液相色譜法、苯酚-硫酸法、Elson-Morgan法、DNS法等。其中，Elson-Morgan法是經(jīng)典的測(cè)定氨基葡萄糖的方法，游離的氨基葡萄糖在堿性條件下與乙酰丙酮縮合生成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，生色原再與對(duì)-二甲氨基苯甲醛在濃鹽酸乙醇溶液中顯色，對(duì)氨基葡萄糖有很好的專(zhuān)一性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的殼聚糖的水解產(chǎn)物收率低、水解效率低、質(zhì)量差的不足之處，提供一種高效、綠色環(huán)保、產(chǎn)率高的氮?dú)獗Ｗo(hù)下酸水解殼聚糖的方法。本發(fā)明以殼聚糖水解液中GAH的產(chǎn)率為指標(biāo)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的環(huán)境下對(duì)殼聚糖水解條件進(jìn)行優(yōu)化，將采用乙酰丙酮法對(duì)水解條件進(jìn)行篩選，優(yōu)選最佳水解條件。

一種利用紫外分光光度法測(cè)定殼聚糖酸水解率的方法，其包括下述步驟：

1)稱(chēng)取300mg殼聚糖加入燒瓶，量取40ml無(wú)機(jī)酸溶液加入燒瓶，密封裝置，用真空泵抽盡空氣，再通入氮?dú)猓貜?fù)3次。啟動(dòng)恒溫磁力攪拌器，控制反應(yīng)溫度100℃、轉(zhuǎn)速200r/min，反應(yīng)時(shí)間為12h～48h，用取樣針?lè)謩e在不同時(shí)間取出適量水解液分別密封保存，作為樣品，放置冰箱備用；

2)紫外分光光度法測(cè)定氨基葡萄糖的含量：

a)繪制A和不同濃度的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：分別吸取1.5mL一定濃度梯度的氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于10mL比色管中用水定容至2mL，分別加入乙酰丙酮溶液1.5mL，搖勻，80℃水浴30min。取下冷卻至室溫，分別加對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液5.0mL，加無(wú)水乙醇至10mL，60℃水浴60min，取下冷卻至室溫，以空白管作對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)534nm時(shí)吸光值。分別做三組平行試驗(yàn)，測(cè)各管吸光度。以測(cè)得吸光度A為縱坐標(biāo)，氨基葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

b)樣品工作液的制備：取步驟1)中水解液樣品1.0mL于50mL容量瓶，用水定容至50mL后充分搖勻，即得樣品工作液；