[發明專利]一種以誘惑紅為探針的共振瑞利散射法測定殼寡糖含量的方法

在審

• 申請號: 201711500051.0
• 申請日: 2017-12-30
• 公開（公告）號: CN109115724A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 白研;蘇政權;毋福海;張艷林
• 申請（專利權）人: 廣東藥科大學
• 主分類號: G01N21/47
• 分類號: G01N21/47
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 孫文卉

本發明涉及一種以誘惑紅為探針的共振瑞利散射法測定殼寡糖含量的方法，屬于大分子檢測領域。本發明于BR緩沖溶液中，殼寡糖和誘惑紅締合后，散射值明顯增大，并在470.5nm處有最大散射峰，且在一定的濃度范圍內，其散射值隨殼寡糖含量的增加而增大，并且在一定濃度范圍內呈線性關系。據此，建立了一種殼寡糖的測定方法，其具有試劑廉價，靈敏度高，重現性好和操作方便等優點，適合在實際應用中推廣使用。

技術領域

本發明涉及一種以誘惑紅為探針的共振瑞利散射法測定殼寡糖含量的方法， 屬于大分子檢測領域。

背景技術

殼寡糖(COS)，又稱低聚葡糖糖胺，是一種堿性氨基寡糖，由2-氨基葡萄 糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成。殼寡糖是殼聚糖的降解產物。分子量在3000 以下，聚合度一般在2-20個單糖單位，具有良好的水溶性。殼寡糖還是自然界 中唯一存在的含有正電荷的堿性氨基寡糖，綠色天然、無副作用，它作為一類新 時代的生理活性物質，除了具有增強免疫、抗腫瘤、降低膽固醇、降血壓、降血 糖、加速體內鈣和鐵的吸收以及關節組織的修復等功能外，還具有防腐抑菌、調 節人體值等作用，這也是殼寡糖區別于其他寡糖的重要特征，殼寡糖已成為國際 上新興的一種功能性低聚糖，特別是在食品、保健品、醫藥以及日用化工領域等 方面的應用前景引起了國內外學者的普遍關注，但殼寡糖含量的測定方法尚不成 熟，因此，一種簡便有效測定殼寡糖的方法就顯得尤為重要。

目前殼寡糖分析研究及測定的方法主要有比色法，色譜法，質譜法，電泳法。 最常見的比色法有如鄔建敏等通過DNS顯色，最終確立了甲殼低聚糖平均聚合 度及其平均相對分子質量。劉琳等利用分光光度法測定了殼寡糖平均聚合度，此 方法已經能夠較為準確地鑒定出殼寡糖的平均聚合度。當然，上述方法因為都是 比色法，靈敏度相對其他方法來說并不算高。剩下的色譜法，質譜法，電泳法存 在步驟復雜，耗時長、成本相對較高等缺點。而目前在國內外，殼寡糖與誘惑紅 結合形成離子締合物用于殼寡糖的分析應用尚未見報道。利用簡便、快速、靈敏 度高的共振瑞利散射方法直接測定殼寡糖含量的相關研究較少，因此，共振瑞利 散射法測定殼寡糖含量有著很大的研究空間及重要意義。

共振瑞利散射法(RRS)是近幾年發展起來的新的分析技術，作為一種新的分 析技術得到越來越多的研究和應用，而本文是通過共振瑞利散射法研究測定殼寡 糖含量的簡便、快捷、靈敏度更高的新方法，殼寡糖和誘惑紅能在一定條件下形 成離子締合物，共振散射強度因此顯著增強。再通過共振散射強度與殼寡糖含量 在一定的濃度范圍內呈線性關系，以此作為殼寡糖的定量基礎。

發明內容

一種以誘惑紅為探針的共振瑞利散射法測定殼寡糖含量的方法，其包括下述 步驟：

1)繪制殼寡糖的標準曲線

在一系列10mL比色管中，按先后順序分別加入BR緩沖液1.00mL，一定 濃度梯度的殼寡糖標準液(20.00μg/mL)(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、 6.00mL)，1mL濃度為1.0×10^-4mol/L誘惑紅，以蒸餾水定容后充分搖勻。同時以 試劑空白作參比，在470.5nm處測RRS，以ΔI-c作線性趨勢圖得標準曲線。

2)20μg/mL的樣品工作液的制備：稱取一定量待檢測樣品的膠囊殼，使用 冰醋酸溶解并將其定容得到樣品儲備液，用漏斗脫脂棉過濾儲備液，濾液經 6000r/min，離心機離心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得濃度 為20.00μg/mL的樣品工作液。

3)樣品中殼寡糖含量確定：取樣品工作液2mL，按步驟1)檢測方法進行 測定，在470.5nm處測定其RRS，并計算ΔI＝I-I₀，將ΔI代入線性回歸方程求得 樣品中殼寡糖的含量，同時做加標回收試驗。

如上所述的一種以誘惑紅為探針的共振瑞利散射法測定殼寡糖含量的方法， 其特征在于，所述的BR緩沖液的pH為4.0，且葡萄糖、甘氨酸、維生素C、檸 檬酸等對實驗測定結果干擾較小。