[發(fā)明專利]一種豬干擾素誘生劑的篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711498133.6
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN108181280B
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯永清;吳濤;丁斌鷹;易丹
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢輕工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 深圳市世紀(jì)恒程知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 44287
• 代理人: 胡海國

本發(fā)明公開一種豬干擾素誘生劑的篩選方法，包括以下步驟：體外培養(yǎng)豬小腸細(xì)胞IPEC?1；培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白基因和豬干擾素β基因的細(xì)胞株IPEC?1/AcGFP1?IFN?β；將細(xì)胞IPEC?1/AcGFP1?IFN?β接種到培養(yǎng)板中形成細(xì)胞爬片；用待篩選誘生劑處理細(xì)胞IPEC?1/AcGFP1?IFN?β，得待測細(xì)胞，并觀測待測細(xì)胞的AcGFP1熒光強(qiáng)度，根據(jù)AcGFP1熒光強(qiáng)度篩選出豬干擾素誘生劑。本發(fā)明提出的豬干擾素誘生劑的篩選方法，具有具有篩選快速、針對性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，篩選出來的豬干擾素誘生劑可直接作為飼料添加劑加入仔豬飼料中，用于誘導(dǎo)仔豬體內(nèi)產(chǎn)生干擾素而實(shí)現(xiàn)抵抗仔豬疾病的作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及豬飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種豬干擾素誘生劑的篩選方法。

背景技術(shù)

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及現(xiàn)代畜牧業(yè)的需要，免疫增強(qiáng)劑的預(yù)防、保健作用越來越受到重視，特性確定、高效、穩(wěn)定、無毒的免疫增強(qiáng)劑將是未來防治畜禽疾病的理想物質(zhì)。豬用免疫增強(qiáng)劑主要包括干擾素(Interferon，IFN)、豬用轉(zhuǎn)移因子、免疫球蛋白、低聚糖、黃芪多糖等，其中，干擾素是多種誘導(dǎo)劑(病毒、細(xì)菌和大分子等)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能的一類蛋白質(zhì)，在豬病的防治中起到至關(guān)重要的作用。

盡管干擾素具有廣譜抗病毒活性，得到廣泛的應(yīng)用，但是由于干擾素具有較強(qiáng)的種屬特異性，即人的干擾素只能用于人，雞的干擾素只能用于雞，因此，干擾素在實(shí)際使用過程中還需要經(jīng)過嚴(yán)格的篩選?，F(xiàn)有技術(shù)中，開展了大量以中草藥為原材料，提取、篩選其有效成份配制成抗毒素I號(hào)，作為內(nèi)源性干擾素誘生劑的研究，并應(yīng)用到家畜、家禽及野生功物病毒性疾病的防治。但是這種方法的篩選周期長，而且由于篩選目的不明確使得篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性不高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的是提出一種豬干擾素誘生劑的篩選方法，旨在縮短豬干擾素誘生劑的篩選方法的篩選周期，并提高篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種豬干擾素誘生劑的篩選方法，包括以下步驟：

步驟S10、體外培養(yǎng)豬小腸細(xì)胞系，獲得豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1；

步驟S20、以豬血基因組為模板，用豬干擾素β基因的特異性引物p1和p2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因IFN-β片段，并將目的基因IFN-β片段與pMD18T克隆載體連接后進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，命名為pMD18T-IFN-β；

步驟S30、用Xho I和Sal I酶對質(zhì)粒pMD18T-IFN-β和含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體pIRES2-AcGFP1進(jìn)行雙酶切，并回收目的基因IFN-β片段和線性化的pIRES2-AcGFP1載體片段，將目的基因IFN-β片段與線性化的pIRES2-AcGFP1載體片段連接后進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取重組質(zhì)粒，命名為pIRES2-AcGFP1-IFN-β；

步驟S40、將豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1接至孔板中，待細(xì)胞融合至75～85％時(shí)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β和對照質(zhì)粒pIRES2-AcGFP1，轉(zhuǎn)染22～26h后向IPEC-1細(xì)胞中加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)AcGFP1和IFN-β的細(xì)胞株，命名為IPEC-1/AcGFP1-IFN-β；

步驟S50、將細(xì)胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β接至培養(yǎng)板上，用待篩選誘生劑處理細(xì)胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β，70～74h后取出細(xì)胞爬片并觀察細(xì)胞的AcGFP1熒光強(qiáng)度，并根據(jù)AcGFP1熒光強(qiáng)度，從待篩選誘生劑中篩選出豬干擾素誘生劑。

優(yōu)選地，步驟S10包括：

將凍存有豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1的凍存管置于CO₂培養(yǎng)箱中融化后，取出豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1并放入培養(yǎng)皿，向培養(yǎng)皿中加入細(xì)胞培養(yǎng)液后置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；