[發明專利]一種豬干擾素誘生劑的篩選方法

有效

• 申請號: 201711498133.6
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108181280B
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 侯永清;吳濤;丁斌鷹;易丹
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287
• 代理人: 胡海國

1.一種豬干擾素誘生劑的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟S10、體外培養豬小腸細胞系，獲得豬小腸上皮細胞IPEC-1；

步驟S20、以豬血基因組為模板，用豬干擾素β基因的特異性引物p1和p2進行PCR擴增，得到目的基因IFN-β片段，并將目的基因IFN-β片段與pMD18T克隆載體連接后進行培養，然后提取質粒，命名為pMD18T-IFN-β；

步驟S30、用Xho I和Sal I酶對質粒pMD18T-IFN-β和含有綠色熒光蛋白基因的表達載體pIRES2-AcGFP1進行雙酶切，并回收目的基因IFN-β片段和線性化的pIRES2-AcGFP1載體片段，將目的基因IFN-β片段與線性化的pIRES2-AcGFP1載體片段連接后進行培養，然后提取重組質粒，命名為pIRES2-AcGFP1-IFN-β；

步驟S40、將豬小腸上皮細胞IPEC-1接至孔板中，待細胞融合至75～85％時，轉染重組質粒pIRES2-AcGFP1-IFN-β和對照質粒pIRES2-AcGFP1，轉染22～26h后向IPEC-1細胞中加入培養基繼續培養，獲得穩定表達AcGFP1和IFN-β的細胞株，命名為IPEC-1/AcGFP1-IFN-β；

步驟S50、將細胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β接至培養板上，用待篩選誘生劑處理細胞IPEC-1/AcGFP1-IFN-β，70～74h后取出細胞爬片并觀察細胞的AcGFP1熒光強度，并根據AcGFP1熒光強度，從待篩選誘生劑中篩選出豬干擾素誘生劑；

其中，在步驟S20中，所述特異性引物p1的序列為5-GCCTCGAGATGGCTAACAAGTGCA-3，所述特異性引物p2的序列為5-GGTCGACTCAGTTCCGGAGGTAAT-3。

2.如權利要求1所述的豬干擾素誘生劑的篩選方法，其特征在于，步驟S10包括：

將凍存有豬小腸上皮細胞IPEC-1的凍存管置于CO₂培養箱中融化后，取出豬小腸上皮細胞IPEC-1并放入培養皿，向培養皿中加入細胞培養液后置于CO₂培養箱中培養；

培養至細胞長滿培養皿表面積的85～95％時，用磷酸鹽緩沖液進行沖洗，然后加入胰酶，并置于CO₂培養箱中消化8～12min，再加入完全培養基終止消化；

將終止消化后的細胞全部轉移至離心管中，于800～1200rpm離心2～5min，然后加入完全培養基并轉移至培養皿中繼續培養1～3天，獲得豬小腸上皮細胞IPEC-1。

3.如權利要求1所述的豬干擾素誘生劑的篩選方法，其特征在于，步驟S20包括：

根據已知的豬干擾素β基因IFN-β(Gene ID：NC_010443.5)序列設計特異性引物上游引物p1和下游引物p2，在上下游引物對應加入Xho I和Sal I酶切位點；

采取豬血液，以淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，以血液RNA提取試劑盒提取RNA，以cDNA合成試劑盒通過反轉錄獲得cDNA，然后以此cDNA為模板，用特異性引物p1和p2進行PCR擴增，對擴增片段進行凝膠電泳檢測，得到豬干擾素β基因的目的基因IFN-β片段；

通過凝膠電泳回收目的基因IFN-β片段，并將目的基因IFN-β片段與pMD18T克隆載體進行連接后，轉化到大腸桿菌感受態細胞DH5a中，通過氨芐抗性篩選，獲得陽性克隆；

挑起陽性克隆進行培養后，以質粒提取試劑盒提取質粒，并通過Xho I和Sal I雙酶切對所提取的質粒進行酶切鑒定和測序分析，測序分析正確的質粒命名為pMD18T-IFN-β。