[發明專利]判斷PCR結果是否為假陽性的方法

有效

• 申請號: 201711498072.3
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108085371B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 李陽
• 申請（專利權）人: 武漢艾德士生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林;徐瑛

本發明公開一種判斷PCR結果是否為假陽性的方法，先估算出在PCR體系內將要加入的目標基因模板分子數量；然后根據目標基因模板分子數量向PCR體系內添加內參模板，所述內參模板的分子數量控制在目標基因模板分子數量的1/n；所述內參模板和目標基因模板高度同源，使得PCR引物能夠以相同效率擴增內參模板和目標基因模板，然后對擴增結果進行測序分析；當擴增結果以目標基因片段為主，說明樣品為陽性；當擴增結果以內參模板為主，則說明樣品為陰性。本發明根據目標基因模板分子數量加入適量的內參模板，一方面能夠壓制污染信號，其抗污染能力可以達到Southern blot的級別，另一方面，本發明通過簡單的PCR技術就可以對轉基因陽性進行鑒定，可信度高，成本低廉。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及判斷PCR結果是否為假陽性的方法。

背景技術

PCR反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，PCR的最大特點是能在生物體外將微量的DNA大幅增加。PCR技術具有高靈敏性，得到了廣泛的應用，但是作為基因檢測的必備方案，也存在著缺點，因為其過于靈敏，容易被環境中微量DNA污染，出現假陽性，例如在轉基因檢測的實驗中，因為經常擴增gus,hyg等標記基因，一段時間過后，在不加任何模板的情況下依然能夠擴增出這些片段，這是很多生物實驗室遇到的頭疼的問題，以至于檢測結果不可信，不得不再依賴于southern blot技術作為最終的轉基因陽性鑒定標準。而southern blot的實驗技術要求高，增加實驗成本。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術存在的問題，提供一種判斷PCR結果是否為假陽性的方法，通過前期添加相對少量的內參陽性模板用于壓制污染信號，然后對PCR結果進行進一步的分析判斷結果是否可信。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

判斷PCR結果是否為假陽性的方法，先估算出如果在目標基因存在的情況下，在PCR 體系內將要加入的目標基因模板分子數量；然后根據目標基因模板分子數量向PCR體系內添加內參模板，所述內參模板的加入用于壓制污染，所述內參模板的分子數量控制在目標基因模板分子數量的1/n，n為2～1000的自然數；

所述內參模板和目標基因模板高度同源，兩者只有個別堿基的差別，使得PCR引物能夠以相同效率擴增內參模板和目標基因模板，然后對擴增結果進行測序分析；當擴增結果以目標基因片段為主，說明樣品為陽性；當擴增結果以內參模板為主，則說明樣品為陰性；當陰性樣品被目標模板污染，且污染量不超過預期目標模板數量的1/n，則得到的為可信結果。

優選地，根據添加DNA模板的體積、濃度、以及分子量估算出在PCR體系內將要加入的所述目標基因模板分子數量。例如，檢測轉基因水稻中是否為陽性轉基因植株，水稻基因組DNA濃度X ng/ul可以通過分光光度計測得，水稻基因組約466000000bp，1bp長度的DNA的平均分子量約為650；添加1ul的濃度為X的基因組做模板，添加的目標基因分子的數量N＝X*6.02*10²³/(650*466000000*1000000000),N＝1987*X(約等于2000X) 個；同理內參模板的量可以通過換算獲得。

優選地，所述n為3～10。內參模板的加入是為了壓制污染，對污染的抵抗能力與設計時使用的內參模板相對于預期目標基因模板的分子數量決定的。如果內參模板加入較多，可以更強的壓制污染信號，但是也可能會出現對模板量預估不準的情況下產生假陰性的現象；如果內參模板加入的太少則抗污染能力減弱，優選地設置n＝3～10比較合理,對于目標模板量1/3的污染即使使用southern blot的鑒定方法也無法進行準確鑒定。所以此方案抗污染能力可以到達Southern blot的級別。要想提高抗污染的能力需要盡可能的提高加入目標基因模板的濃度以便可以加入更多的內參模板數量。

優選地，所述測序分析的方法采用一代測序或者二代測序方法。