[發(fā)明專利]一種木芙蓉細胞的懸浮培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711491079.2
• 申請日: 2017-12-30
• 公開（公告）號: CN108034630A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉軍;謝丹
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州紐貝生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N5/02
• 代理公司: 浙江永鼎律師事務所 33233
• 代理人: 陸永強

本發(fā)明公開了一種木芙蓉細胞的懸浮培養(yǎng)方法，是取木芙蓉腋芽作為外植體，進行表面消毒；然后將消毒后的外植體置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)獲得愈傷組織；再進行細胞預培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)和細胞繼代培養(yǎng)，獲得大量的懸浮培養(yǎng)細胞。本發(fā)明通過對木芙蓉進行細胞的懸浮培養(yǎng)，可實現(xiàn)大規(guī)模快速生產(chǎn)出有效成分含量高的木芙蓉細胞培養(yǎng)物，為木芙蓉細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物奠定了良好的基礎(chǔ)。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種木芙蓉細胞的懸浮培養(yǎng)方法。

(二)背景技術(shù)

木芙蓉(Hibiscus mutabilis Linn.)是錦葵科木槿屬多年生小喬木或落葉灌木。在我國南北都有栽培分布。木芙蓉既是重要的觀賞園林花卉，同時更是一種重要的藥用植物，木芙蓉的葉、花、根均可入藥，具有重要醫(yī)藥價值。木芙蓉細胞組織內(nèi)含有富含黃酮酣、金絲桃甙、菊糖甙、酚類、還原糖等藥物成分，木芙蓉有清熱解毒，消腫排膿，涼血止血和調(diào)經(jīng)止血作用。研究表明，木芙蓉的醇浸出物對金黃色葡萄球菌，溶血性鏈球菌有較強的抑制作用，對木芙蓉的各種細胞次生代謝物的開發(fā)也愈加重視。

目前木芙蓉人工種植主要采用扦插繁殖，木芙蓉容易遭受病毒的侵染而在扦插繁殖中又易傳播病毒，從而使優(yōu)良性狀的遺傳資源得不到保護，細胞次生代謝活性物質(zhì)產(chǎn)量也無法得到保證，而種子繁殖生產(chǎn)周期又很長，最重要的是受季節(jié)變化和耕地逐漸減少的影響，導致無法滿足木芙蓉的市場需求。因此迫切需要找到一種能安全、快速而大量生產(chǎn)木芙蓉細胞培養(yǎng)物的途徑和方法。而采用組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能解決木芙蓉品種的繁殖變異問題，還可以通過細胞培養(yǎng)大量生產(chǎn)木芙蓉次生代謝產(chǎn)物。木芙蓉的懸浮細胞系的建立目前還未見報道，在工業(yè)生產(chǎn)中，通過木芙蓉細胞培養(yǎng)是獲得木芙蓉細胞次生代謝藥物和提取藥理活性因子的有效途徑之一，而且可研究木芙蓉生長發(fā)育及分化的機制、遺傳變異規(guī)律，對木芙蓉的遺傳育種具有特殊意義。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種木芙蓉細胞的懸浮培養(yǎng)方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種木芙蓉細胞的懸浮培養(yǎng)方法，所述方法按如下步驟進行：

(1)無菌外植體的獲取：選取生長健康、無病蟲害的木芙蓉腋芽作為外植體，用自來水沖洗30～60min，然后在體積濃度為1％洗潔精的水溶液中振搖2～5min，用無菌水沖凈；在超凈工作臺上用體積濃度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用質(zhì)量濃度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用無菌水沖洗3～5遍，在滅菌的濾紙上吸干水分；

(2)木芙蓉愈傷組織的誘導培養(yǎng)：將消毒后的腋芽接入愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，先在23～28℃下，暗培養(yǎng)10～15天，然后每天光照8～12小時、光照強度為1000～1500lx的條件下進行培養(yǎng)，所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基為添加KT(即6-糠基氨基嘌呤)0.1～0.5mg/L、6-BA(即6-芐氨基腺嘌呤)0.1～1.0mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0～3.0mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.0g/L的MS固體基本培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的pH值為5.8；

(3)細胞的預培養(yǎng)：將步驟(2)中獲得的無褐化的黃白色愈傷組織轉(zhuǎn)接入預培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中進行5～9天的預培養(yǎng)，所述的預培養(yǎng)液體培養(yǎng)基為添加KT 0.1～0.5mg/L、6-BA0.5～1.5mg/L、2，4-D 1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液體基本培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的pH值為5.8；

(4)細胞的懸浮培養(yǎng)：選取預培養(yǎng)后處于懸浮培養(yǎng)液中部和上部的木芙蓉單個細胞或疏松細胞小聚集體，以20～50g/L的接種量轉(zhuǎn)接到細胞懸浮培養(yǎng)基中，所述細胞懸浮培養(yǎng)基為添加KT 0.1～0.5mg/L、6-BA0.1～1.0mg/L、2，4-D 1.0～3.0mg/L、酸水解酪蛋白0.2～0.8g/L、蔗糖30g/L的MS液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的pH值為5.8；