[發(fā)明專利]一種木芙蓉細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711491079.2
• 申請(qǐng)日: 2017-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108034630A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉軍;謝丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州紐貝生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04;C12N5/02
• 代理公司: 浙江永鼎律師事務(wù)所 33233
• 代理人: 陸永強(qiáng)

1.一種木芙蓉細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)無(wú)菌外植體的獲取：選取生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲害的木芙蓉腋芽作為外植體，用自來(lái)水沖洗30～60min，然后在體積濃度為1％洗潔精的水溶液中振搖2～5min，用無(wú)菌水沖凈，在超凈工作臺(tái)上用體積濃度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用質(zhì)量濃度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用無(wú)菌水沖洗3～5遍，在滅菌的濾紙上吸干水分；

(2)木芙蓉愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)：將消毒后的腋芽接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，先在23～28℃下，暗培養(yǎng)10～15天，然后每天光照8～12小時(shí)、光照強(qiáng)度為1000～1500lx的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加KT(即6-糠基氨基嘌呤)0.1～0.5mg/L、6-BA(即6-芐氨基腺嘌呤)0.1～1.0mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0～3.0mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.0g/L的MS固體基本培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的pH值為5.8；

(3)細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)：將步驟(2)中獲得的無(wú)褐化的黃白色愈傷組織轉(zhuǎn)接入預(yù)培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行5～9天的預(yù)培養(yǎng)，所述的預(yù)培養(yǎng)液體培養(yǎng)基為添加KT 0.1～0.5mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L、2，4-D 1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液體基本培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的pH值為5.8；

(4)細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)：選取預(yù)培養(yǎng)后處于懸浮培養(yǎng)液中部和上部的木芙蓉單個(gè)細(xì)胞或疏松細(xì)胞小聚集體，以20～50g/L的接種量轉(zhuǎn)接到細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基中，所述細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基為添加KT 0.1～0.5mg/L、6-BA 0.1～1.0mg/L、2，4-D 1.0～3.0mg/L、酸水解酪蛋白0.2～0.8g/L、蔗糖30g/L的MS液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的pH值為5.8；

(5)細(xì)胞的繼代培養(yǎng)：在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)了15～25天進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)，以后每隔15～25天繼代一次；

上述(3)、(4)、(5)步驟中木芙蓉細(xì)胞的培養(yǎng)條件均為溫度23～28℃，pH值5.8，每天光照6～12小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木芙蓉細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(2)所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加KT 0.2mg/L、6-BA 0.5mg/L、2，4-D 2.0mg/L的MS固體基本培養(yǎng)基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木芙蓉細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(3)所述木芙蓉細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)液體培養(yǎng)基為添加KT 0.2mg/L、6-BA 1.0mg/L、2、4-D 2.0mg/L的MS液體基本培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為7天。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木芙蓉細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(4)所述木芙蓉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基為添加KT 0.2mg/L、6-BA0.5mg/L、2，4-D 2.0mg/L、酸水解酪蛋白0.6g/L的MS液體基本培養(yǎng)基,pH值為5.8、蔗糖30g/L,細(xì)胞團(tuán)接種量是30g/L。