[發明專利]一種石榴細胞的懸浮培養方法

在審

• 申請號: 201711491077.3
• 申請日: 2017-12-30
• 公開（公告）號: CN108018255A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 劉軍;謝丹
• 申請（專利權）人: 杭州紐貝生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 浙江永鼎律師事務所 33233
• 代理人: 陸永強

1.一種石榴細胞的懸浮培養方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)無菌外植體的獲取：選取生長健康、無病蟲害的石榴腋芽作為外植體，用自來水沖洗30～60min，然后在體積濃度為1％洗潔精的水溶液中振搖2～5min，用無菌水沖凈，在超凈工作臺上用體積濃度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用質量濃度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用無菌水沖洗3～5遍，在滅菌的濾紙上吸干水分；

(2)石榴愈傷組織的誘導培養：將消毒后的腋芽接入愈傷組織誘導培養基中，先在23～28℃下，暗培養10～15天，然后每天光照8～12小時、光照強度為1000～1500lx的條件下進行培養，所述的愈傷組織誘導培養基為添加6-BA(即6-芐氨基腺嘌呤)0.5～2.0mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0～3.0mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.0g/L的MS固體基本培養基,培養基的pH值為5.8；

(3)細胞的預培養：將步驟(2)中獲得的無褐化的黃白色愈傷組織轉接入預培養液體培養基中進行5～9天的預培養，所述的預培養液體培養基為添加6-BA 0.5～1.5mg/L、2，4-D1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液體基本培養基,培養基的pH值為5.8；

(4)細胞的懸浮培養：選取預培養后處于懸浮培養液中部和上部的石榴單個細胞或疏松細胞小聚集體，以20～50g/L的接種量轉接到細胞懸浮培養基中，所述細胞懸浮培養基為添加6-BA 0.1～1.0mg/L、2，4-D 1.0～3.0mg/L、酸水解酪蛋白0.2～0.8g/L、蔗糖30g/L的MS液體培養基,培養基的pH值為5.8；

(5)細胞的繼代培養：在細胞懸浮培養了15～25天進行第一次繼代培養，以后每隔15～25天繼代一次；

上述(3)、(4)、(5)步驟中石榴細胞的培養條件均為溫度23～28℃，pH值5.8，每天光照6～12小時，光照強度為1000～1500lx，搖床轉速為120r/min。

2.根據權利要求1所述的石榴細胞的懸浮培養方法，其特征在于：步驟(2)所述愈傷組織誘導培養基為添加6-BA 1.0mg/L、2，4-D 1.5mg/L的MS固體基本培養基。

3.根據權利要求1所述的石榴細胞的懸浮培養方法，其特征在于：步驟(3)所述石榴細胞的預培養液體培養基為添加6-BA0.8mg/L、2、4-D 2.0mg/L的MS液體基本培養基，預培養時間為7天。

4.根據權利要求1所述的石榴細胞的懸浮培養方法，其特征在于：步驟(4)所述石榴細胞懸浮培養基為添加6-BA0.5mg/L、2，4-D 2.0mg/L、酸水解酪蛋白0.6g/L的MS液體基本培養基,pH值為5.8、蔗糖30g/L，細胞團接種量是30g/L。