[發明專利]一種石榴細胞的懸浮培養方法

在審

• 申請號: 201711491077.3
• 申請日: 2017-12-30
• 公開（公告）號: CN108018255A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 劉軍;謝丹
• 申請（專利權）人: 杭州紐貝生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 浙江永鼎律師事務所 33233
• 代理人: 陸永強

本發明公開了一種石榴細胞的懸浮培養方法，是取石榴腋芽作為外植體，進行表面消毒；然后將消毒后的外植體置于愈傷組織誘導培養基上，進行培養獲得愈傷組織；再進行細胞預培養、細胞懸浮培養和細胞繼代培養，獲得大量的懸浮培養細胞。本發明通過采用對石榴細胞的懸浮培養，可實現大規模快速生產出均勻一致的有效成分含量高的石榴細胞培養物，為石榴細胞懸浮培養生產次生代謝產物奠定了良好的基礎。

(一)技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種石榴細胞的懸浮培養方法。

(二)背景技術

石榴(Punica granatumL.)是石榴科石榴屬多年生落葉喬木或灌木，在我國南北都有栽培分布。石榴既是重要的食用水果植物，同時更是一種重要的藥用植物。石榴的葉、花、根、果皮均可入藥，具有重要醫藥價值,其細胞組織內含有蘋果酸、鞣質、生物堿等多種成分，具有多種醫藥用途，石榴花中的活性物質還有止血功能。研究表明，石榴的醇浸出物及果皮水煎劑，具有廣譜抗菌作用，其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、霍亂弧菌、痢疾桿菌等有明顯的抑制作用，石榴皮以及石榴樹根皮提取的活性物質對人體的寄生蟲有麻醉作用，是驅蟲殺蟲藥的重要成分。

目前石榴人工種植主要采用扦插繁殖，石榴容易遭受病毒的侵染而在扦插繁殖中傳播病毒，從而使優良性狀的遺傳資源得不到保護，而種子繁殖周期又很長，最重要的是受季節變化和耕地逐漸減少的影響，無法滿足石榴的市場需求。由于人工種植石榴存在上述問題，因此迫切需要找到一種能安全、快速而大量生產有效成分含量高的石榴細胞培養物的途徑和方法。而采用組織培養技術不僅能解決石榴品種的繁殖變異問題，還可以通過細胞培養大量生產石榴堿次生代謝產物。石榴的懸浮細胞系的建立目前還未見報道，在工業生產中，通過石榴細胞培養是獲得石榴細胞次生代謝藥物和提取藥理活性因子的有效途徑之一，而且可研究石榴生長發育及分化的機制、遺傳變異規律，對石榴的遺傳育種具有特殊意義。

(三)發明內容

本發明的目的在于提供一種石榴細胞的懸浮培養方法。

本發明采用的技術方案是：

一種石榴細胞的懸浮培養方法，所述方法按如下步驟進行：

(1)無菌外植體的獲取：選取生長健康、無病蟲害的石榴腋芽作為外植體，用自來水沖洗30～60min，然后在體積濃度為1％洗潔精的水溶液中振搖2～5min，用無菌水沖凈；在超凈工作臺上用體積濃度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用質量濃度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用無菌水沖洗3～5遍，在滅菌的濾紙上吸干水分；

(2)石榴愈傷組織的誘導培養：將消毒后的腋芽接入愈傷組織誘導培養基中，先在23～28℃下，暗培養10～15天，然后每天光照8～12小時、光照強度為1000～1500lx的條件下進行培養，所述的愈傷組織誘導培養基為添加6-BA(即6-芐氨基腺嘌呤)0.5～2.0mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0～3.0mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.0g/L的MS固體基本培養基,培養基的pH值為5.8；

(3)細胞的預培養：將步驟(2)中獲得的無褐化的黃白色愈傷組織轉接入預培養液體培養基中進行5～9天的預培養，所述的預培養液體培養基為添加6-BA0.5～1.5mg/L、2，4-D 1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液體基本培養基,培養基的pH值為5.8；

(4)細胞的懸浮培養：選取預培養后處于懸浮培養液中部和上部的石榴單個細胞或疏松細胞小聚集體，以20～50g/L的接種量轉接到細胞懸浮培養基中，所述細胞懸浮培養基為添加6-BA 0.1～1.0mg/L、2，4-D 1.0～3.0mg/L、酸水解酪蛋白0.2～0.8g/L、蔗糖30g/L的MS液體培養基,培養基的pH值為5.8；

(5)細胞的繼代培養：在細胞懸浮培養了15～25天進行第一次繼代培養，以后每隔15～25天繼代一次；