[發明專利]一種用于純化蛋白的表達載體

有效

• 申請號: 201711489413.0
• 申請日: 2017-12-30
• 公開（公告）號: CN108218997B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 王天澤;郝淑靜
• 申請（專利權）人: 北京中科唯新生物醫學研究所有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/14;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京展翅星辰知識產權代理有限公司 11693
• 代理人: 魏威

1.一種表達載體在純化蛋白中的應用，所述表達載體包括S100蛋白家族基因編碼序列以及其他載體元件，所述S100蛋白家族基因編碼序列位于能夠正常表達的區域，其特征在于，包括如下步驟：

a) 使用所述表達載體構建S100蛋白與待純化蛋白的重組融合蛋白表達載體;

b) 所述重組融合蛋白的表達:得到表達細胞;

c) 所述重組融合蛋白的分離純化:收集所述表達細胞，破碎所述表達細胞，離心并收集含所述重組融合蛋白的上清液,所述上清液進行陰離子交換柱初步分離,經過上樣、洗脫并收集混合在300至400毫升范圍內的洗脫液樣品,向所述洗脫液樣品中加入氯化鈣(CaCl₂),上疏水層析柱，得到所述疏水層析柱純化后的融合蛋白；

d) 電泳鑒定;

e) 酶切純化所述疏水層析柱純化后的融合蛋白，得到待純化蛋白。

2.根據權利要求1所述的表達載體在純化蛋白中的應用，其特征在于：所述其他載體元件包括多克隆位點、篩選標記、操縱子、啟動子以及終止子，所述多克隆位點區內包括所述S100蛋白家族基因編碼序列。

3.根據權利要求1所述的表達載體在純化蛋白中的應用，其特征在于：所述表達載體是原核表達載體或真核表達載體。

4.根據權利要求1至3任一所述的表達載體在純化蛋白中的應用，其特征在于：所述S100蛋白家族基因編碼序列為S100A蛋白家族基因編碼序列、S100B蛋白家族基因編碼序列、S100C蛋白家族基因編碼序列、S100D蛋白家族基因編碼序列、S100E蛋白家族基因編碼序列、S100F蛋白家族基因編碼序列、S100P蛋白家族基因編碼序列、S100G蛋白家族基因編碼序列、S100L蛋白家族基因編碼序列或S100Z蛋白家族基因編碼序列。

5.根據權利要求4所述的表達載體在純化蛋白中的應用, 其特征在于:所述S100A蛋白家族基因編碼序列為S100A1、S100A2、S100A3、S100A4、S100A5、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、S100A10、S100A11、S100A12、S100A13、S100A14、S100A15或S100A16。

6.根據權利要求1至3、5中任一所述的表達載體在純化蛋白中的應用，其特征在于，滿足下列中的一項或幾項：

所述步驟a)中選擇載體pET32a-S100構建所述待純化蛋白的重組融合蛋白表達載體，鑒定所述重組融合蛋白的基因序列,獲得陽性的重組表達載體；和/或

所述步驟c)中，所述上清液上DEAE-瓊脂糖凝膠FF(DEAE-sephrose FF)陰離子交換柱進行初步的分離,所述上樣的緩沖液是25 毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，pH為 7.5，100毫摩爾/升氯化鈉(NaCl)，所述洗脫的緩沖液是25 毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，pH為 7.5，1摩爾/升氯化鈉(NaCl)；向所述樣品中加入5毫摩爾/升氯化鈣(CaCl₂),水系濾器過濾,過濾后的所述樣品上疏水層析柱，加入所述上疏水層析柱的平衡緩沖液三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，所述上疏水層析柱的洗脫緩沖液是三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)和乙二醇雙-2-氨基乙基醚-四乙酸(EGTA)。

7.根據權利要求4所述的表達載體在純化蛋白中的應用，其特征在于，滿足下列中的一項或幾項：

所述步驟a)中選擇載體pET32a-S100構建所述待純化蛋白的重組融合蛋白表達載體，鑒定所述重組融合蛋白的基因序列,獲得陽性的重組表達載體；和/或

所述步驟c)中，所述上清液上DEAE-瓊脂糖凝膠FF(DEAE-sephrose FF)陰離子交換柱進行初步的分離,所述上樣的緩沖液是25 毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，pH為 7.5，100毫摩爾/升氯化鈉(NaCl)，所述洗脫的緩沖液是25 毫摩爾/升三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，pH為 7.5，1摩爾/升氯化鈉(NaCl)；向所述樣品中加入5毫摩爾/升氯化鈣(CaCl₂),水系濾器過濾,過濾后的所述樣品上疏水層析柱，加入所述上疏水層析柱的平衡緩沖液三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，所述上疏水層析柱的洗脫緩沖液是三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (Tris-HCl)和乙二醇雙-2-氨基乙基醚-四乙酸(EGTA)。