[發明專利]用于檢測灰葡萄孢對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性的試劑盒

在審

• 申請號: 201711489329.9
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108018374A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 羅朝喜;范飛;林楊;陰偉曉
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

本發明提供一種用于檢測灰葡萄孢對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性的試劑盒。該試劑盒中包括引物組合，所述引物組合為引物組I、引物組II、和/或引物組III；引物組I由Tub?F3、Tub?B3、Tub?FIP?E198A和Tub?BIP組成；引物組II由Tub?F3、Tub?B3、Tub?FIP?E198V和Tub?BIP組成；引物組III由Tub?F3、Tub?B3、Tub?FIP?E198K和Tub?BIP組成。本發明提供了一種基于分子水平的方便、靈敏、結果判斷直觀且可在田間操作的灰葡萄孢抗藥性檢測方法，可以保證基層技術員在田間，兩小時內獲得客觀、可靠的檢測結果。

技術領域

本發明涉及植物病原菌抗藥性檢測領域，更具體地，涉及用于檢測灰葡萄孢對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性的引物組合及其試劑盒。

背景技術

由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是果蔬上一種非常普遍的病害，且危害十分嚴重，給果蔬生產造成了巨大的損失。目前防治該病害仍然主要依賴于殺菌劑。苯并咪唑類殺菌劑是生產上現在使用較多的一類殺菌劑。但由于其大量使用，灰葡萄孢已對其產生了抗藥性，而該藥的防治效果也隨之大幅度下降。對抗性菌株進行研究發現，抗性菌株的β-微管蛋白基因的第198位密碼子發生了點突變，使原先的谷氨酸被丙氨酸、纈氨酸或賴氨酸替代(E198A/V/K)。

若在噴藥前就能明確田間是否已產生了抗性菌株，就可以準確制定殺菌劑噴施計劃，以提高防治效果。目前比較常用的檢測方法包括兩種，即以菌絲生長抑制為基礎的傳統的菌落直徑法和基于目標基因的PCR技術。傳統的菌落直徑法需要采集田間菌株，進行單孢分離，然后在添加一系列濃度的殺菌劑培養基上進行培養，檢測殺菌劑對菌絲生長的抑制效應。抗性菌株的β-微管蛋白基因的E198A/V/K點突變是田間大多數病原菌對苯并咪唑類殺菌劑產生抗藥性的原因。有研究在此基礎上設計相應引物，通過擴增片段長度或者測序結果可以對灰葡萄孢的抗藥性進行定性檢測。

傳統的菌絲對藥劑的敏感性測定方法通常需要幾周時間，工作量大，測定樣本數量有限，要求嚴格的無菌操作，難以在早期就發現抗藥性菌株的存在。基于PCR技術的檢測方法，所需儀器價格昂貴，對操作人員的技術要求較高，不適合在田間或者地方市縣等農業部門推廣。

發明內容

為了克服現有技術檢測周期長，工作量大，需要無菌條件，及PCR技術對儀器和人員技術要求高的缺陷，本發明的第一個目的，提供了一種用于檢測灰葡萄孢對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性的引物組合，所述引物組合為引物組I、引物組II、和/或引物組III。

其中，所述引物組I由外引物和內引物組成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3組成，所述內引物由Tub-FIP-E198A和Tub-BIP組成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。

外引物：

Tub-F3：GCAACTCTCTCTGTCCATCAA，如SEQ ID NO.1所示；

Tub-B3：CCAACTTTCGGAGATCTGAGT，如SEQ ID NO.2所示。

內引物：

Tub-FIP-E198A：

GGTTGCTGAGCTTCAAGGTTCTCACAATTGGTTGAGAACTCTGATGC，如SEQ ID NO.3所示；

Tub-BIP：

TCTTAACCACTTGGTTTCCGCCG-AAGTTGACCAGGGAAACGG，如SEQ ID NO.4所示。

其中，所述引物組II由外引物和內引物組成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3組成，所述內引物由Tub-FIP-E198V和Tub-BIP組成，所述Tub-FIP-E198V的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。