[發明專利]用于檢測灰葡萄孢對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性的試劑盒

在審

• 申請號: 201711489329.9
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108018374A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 羅朝喜;范飛;林楊;陰偉曉
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

1.用于檢測灰葡萄孢對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性的引物組合，所述引物組合為引物組I、引物組II、和/或引物組III；

所述引物組I由外引物和內引物組成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3組成，所述內引物由Tub-FIP-E198A和Tub-BIP組成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；

所述引物組II由外引物和內引物組成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3組成，所述內引物由Tub-FIP-E198V和Tub-BIP組成，所述Tub-FIP-E198V的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述引物組III由外引物和內引物組成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3組成，所述內引物由Tub-FIP-E198K和Tub-BIP組成，所述Tub-FIP-E198K的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.含有權利要求1所述引物組合的試劑盒。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括：Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgSO4溶液和甜菜堿溶液。

4.權利要求1所述的引物組合或權利要求2或3所述的試劑盒在檢測灰葡萄孢對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，包括如下步驟：

1)提取待測灰葡萄孢的基因組DNA；

2)以步驟1)提取的基因組DNA為模板，采用所述引物組合進行環介導等溫擴增；

3)分析步驟2)得到的擴增產物。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟2)中環介導等溫擴增的反應總體積為25μL，反應體系為：4U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Buffer，4mM MgSO4溶液，1mM dNTPs，所述內引物各為1.2mM，所述外引物各為0.4mM，0.8M甜菜堿和1μL所述基因組DNA。

7.根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于，步驟2)中環介導等溫擴增的條件為：63℃60min，85℃10min。

8.根據權利要求5至7中任一項所述的應用，其特征在于，步驟1)中使用10×TE裂解液提取待測灰葡萄孢的基因組DNA。

9.根據權利要求5至8中任一項所述的應用，其特征在于，步驟3)具體為：

向步驟2)得到的擴增產物中加入SYBR Green I染料后觀察顏色反應；

或，對步驟2)得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

10.根據權利要求4至9中任一項所述的應用，其特征在于，所述應用適用于田間檢測。