[發(fā)明專利]用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的引物對(duì)、試劑盒及方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711487648.6
• 申請(qǐng)日: 2017-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN107904313A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓林志;肖芳;許麗媛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 韓林志
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的引物對(duì)，其特征在于，包括針對(duì)Reprimo基因與RNF180基因的啟動(dòng)子區(qū)以及β-Actin內(nèi)參基因的特異性引物及探針，如下：

Reprimo正向引物：5'-TGCGAGTGAGCGTTTAGTTC-3'，

Reprimo反向引物：5'-TCCGTCTAATTACCTAAAACCGA-3'，

Reprimo檢測(cè)探針：5'-AACGAACGAACGCCGCGAACGAC-3'；

RNF180正向引物：5'-TGCGGGGTTTGGTTTTTGT-3'，

RNF180反向引物：5'-AAAACCTCCAACTTCACACCC-3'，

RNF180檢測(cè)探針：5'-CGTCGTCGGAGTCGTAGCGAGTTT-3'；

其中，所述Reprimo檢測(cè)探針及RNF180檢測(cè)探針的5'端分別使用FAM，VIC標(biāo)記作為發(fā)光基團(tuán)，3'端均使用BHQ1作為淬滅基團(tuán)；

β-Actin正向引物：5'-ATTTGAGATGTATGAAGGTTTTTGG-3'，

β-Actin反向引物：5'-ACACCACAAAATCACACTTAACCT-3'，

β-Actin檢測(cè)探針：5'-AAACCCTAACTACCTCCACCCACTCCCA-3'；

其中，所述β-Actin檢測(cè)探針的5'端使用ROX標(biāo)記作為發(fā)光基團(tuán)，3'端使用BHQ2作為淬滅基團(tuán)。

2.一種用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，包括含有如權(quán)利要求1所述的特異性引物及探針的PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括：Reprimo正向引物、Reprimo反向引物及Reprimo檢測(cè)探針，RNF180正向引物、RNF180反向引物及RNF180檢測(cè)探針，β-Actin正向引物、β-Actin反向引物及β-Actin檢測(cè)探針，10×PCR buffer，dNTP、Mg²⁺及無(wú)核酸酶水。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括Ex Taq酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液的成分終濃度為：1×PCR buffer，0.4μM Reprimo正向引物、0.4μM Reprimo反向引物、0.2μM Reprimo檢測(cè)探針，0.4μM RNF180正向引物、0.4μM RNF180反向引物、0.2μM RNF180檢測(cè)探針，0.4μM β-Actin正向引物、0.4μM β-Actin反向引物、0.2μM β-Actin檢測(cè)探針，4.0mM dNTP，4.0mM Mg²⁺。

5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，還包括陽(yáng)性對(duì)照品及陰性對(duì)照品，所述陽(yáng)性對(duì)照品分別為Reprimo甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA及RNF180甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA，所述陰性對(duì)照品為非甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA。

6.一種用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：取待檢測(cè)樣本抽提的DNA，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，轉(zhuǎn)化后的DNA作為PCR的模板；

步驟二：提供如權(quán)利要求5所述的試劑盒，對(duì)所述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

步驟三：結(jié)果分析，檢測(cè)結(jié)果滿足質(zhì)控要求，即待檢測(cè)樣本β-actin的檢測(cè)Ct值≤33時(shí)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)樣本進(jìn)行判斷；根據(jù)樣本檢測(cè)結(jié)果Reprimo基因Ct值與Reprimo預(yù)先設(shè)定Ct值的差別，判斷待檢測(cè)樣本Reprimo基因甲基化檢測(cè)是否為陽(yáng)性；根據(jù)樣本檢測(cè)結(jié)果RNF180基因Ct值與RNF180預(yù)先設(shè)定Ct值的差別，判斷樣本RNF180基因甲基化檢測(cè)是否為陽(yáng)性。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的方法，其特征在于，所述步驟一中轉(zhuǎn)化處理所采用的試劑為亞硫酸氫鹽或重亞硫酸鹽。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的方法，其特征在于，所述步驟二中PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 2min；95℃變性5min；45cycles，95℃ 15sec，55℃ 45sec。