[發(fā)明專(zhuān)利]用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的引物對(duì)、試劑盒及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711487648.6
• 申請(qǐng)日: 2017-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107904313A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓林志;肖芳;許麗媛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 韓林志
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別的，涉及一種用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的引物對(duì)、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

Reprimo基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種潛在的抑癌基因，位于人類(lèi)染色體2q23上，是調(diào)控細(xì)胞正常生長(zhǎng)的基因之一。其編碼的蛋白位于胞質(zhì)，是一種高度糖基化的蛋白，是p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控的下游信號(hào)，可使異常的細(xì)胞停滯在G2期，阻止細(xì)胞增殖。Reprimo啟動(dòng)子異常甲基化可以抑制轉(zhuǎn)錄，引起G2/M檢查點(diǎn)調(diào)控發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。Reprimo基因甲基化及其表達(dá)的缺失與多種癌癥或腫瘤細(xì)胞株相關(guān)，其中包括胃癌、膽囊癌、淋巴瘤、大腸癌、食管腺癌、乳腺癌及白血病，其中Reprimo基因啟動(dòng)子甲基化在胃癌患者中占比率大于70％。此外，胃癌患者血漿中發(fā)現(xiàn)的APC，SHP1，E-cadherin，ER，Reprimo，SEMA3B，and 3OST2等7種高頻率甲基化的基因中，只有Reprimo基因在非胃癌患者的血漿中是呈顯著性低頻率甲基化，這說(shuō)明Reprimo可以做為胃癌早期的腫瘤標(biāo)志物。另一方面，增強(qiáng)Reprimo mRNA及蛋白的表達(dá)通過(guò)使用去甲基化制劑可使抑癌基因重獲作用，其干擾下可能減少Reprimo異常甲基化的發(fā)生，并且聯(lián)合應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿┖?，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果更顯著，這為腫瘤的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)腫瘤患者預(yù)后有重要意義。

RNF180基因在人類(lèi)基因組中定位于5q12.3，是一個(gè)新型的環(huán)指基序基因，有泛素連接酶活性和蛋白質(zhì)泛素化功能。RNF180通過(guò)對(duì)底物的泛素化進(jìn)而決定了其靶向特異性及時(shí)序性，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄及DNA修復(fù)等介導(dǎo)蛋白降解，RNF蛋白在腫瘤中表達(dá)的異常下調(diào)表現(xiàn)為抑癌因子的作用。全基因組甲基化的篩選結(jié)果顯示RNF180基因在腫瘤中優(yōu)先進(jìn)行甲基化，RNF180基因甲基化的沉默導(dǎo)致了RNF180蛋白酶體途徑失調(diào)，在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中起重要的作用。進(jìn)一步的研究表明，RNF180表達(dá)缺失和低表達(dá)與RNF180基因核心啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)組織水平驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性胃癌組織相對(duì)癌旁組織中RNF180mRNA和蛋白表達(dá)顯著性下降，在胃癌的體外細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)中RNF180經(jīng)常性缺失和下調(diào)，以上結(jié)果均與RNF180基因核心啟動(dòng)子甲基化密切相關(guān)。

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl-transferase，DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的一種反應(yīng)，CG二核苷酸是最主要的甲基化位點(diǎn)，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域。DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，甲基化的胞嘧啶不變，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。用特異性引物PCR擴(kuò)增的方法擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，再進(jìn)行DNA測(cè)序，區(qū)分胞嘧啶的甲基化和非甲基化。如果已經(jīng)確定了甲基化位點(diǎn)，可應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)進(jìn)行檢測(cè)。

目前，傳統(tǒng)的甲基化檢測(cè)方法包括：甲基化特異性PCR及亞硫酸氫鹽測(cè)序法。然而這些方法存在操作繁瑣、準(zhǔn)確性低及敏感性不高的缺點(diǎn)，限制了其在臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用；此外，市面上未見(jiàn)有針對(duì)Reprimo基因、RNF180基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)的試劑盒產(chǎn)品。

因此，有必要提供一種新的用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的引物組、試劑盒及方法來(lái)克服上述缺陷。本發(fā)明采用熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，對(duì)病人血漿游離核酸Reprimo基因、RNF180基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)，通過(guò)對(duì)樣本進(jìn)行重亞硫酸鹽處理后，采用特異性引物和探針對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，以達(dá)到快速檢測(cè)Reprimo基因、RNF180基因甲基化的目的，最終為人胃癌早期診斷提供有效信息，為人胃癌早發(fā)現(xiàn)早治療提供一種簡(jiǎn)便易行的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述傳統(tǒng)甲基化檢測(cè)方法存在操作繁瑣、準(zhǔn)確性低及敏感性不高的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高及敏感性高且基于熒光PCR技術(shù)的用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的引物對(duì)、試劑盒及其方法。

本發(fā)明提供了一種用于胃癌相關(guān)基因Reprimo、RNF180甲基化檢測(cè)的引物對(duì)，包括針對(duì)Reprimo基因與RNF180基因的啟動(dòng)子區(qū)以及β-Actin內(nèi)參基因的特異性引物及探針，如下：

Reprimo正向引物：5'-TGCGAGTGAGCGTTTAGTTC-3'(SEQ ID NO.1)，