[發明專利]一組鑒定僵蠶的特異性引物及其鑒定方法

有效

• 申請號: 201711487245.1
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN107937567B
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 楊歡;周瑩;沈玉萍;楊婭婭;吳啟南;夏國華;陳宇菲;鹿蓓蓓
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/10;C12N15/11
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本發明涉及一組鑒定僵蠶的特異性引物及其鑒定方法，屬于中藥鑒定技術領域；本發明將僵蠶樣品粉碎后采用CTAB法同時提取家蠶和菌物中的DNA，并以此為模板，選用經設計與篩選得到的特異性核苷酸序列為引物進行PCR擴增，繼而將產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析與凝膠成像系統檢測，最終依據檢測結果判別僵蠶的真偽和摻偽情況；通過本發明的方法判斷樣品是否為僵蠶偽品或摻偽品，操作簡單、無需測序、專屬性強、快速準確，在僵蠶樣品真偽鑒定中具有獨特的優勢及重要的應用價值。

技術領域

本發明涉及一組鑒定僵蠶的特異性引物及其鑒定方法，屬于中藥鑒定領域。

背景技術

僵蠶，為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx mori Linnaeus 4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuilknt而致死的干燥體。多于春、秋季生產，將感染白僵菌病死的蠶干燥。僵蠶始載于《神農本草經》，應用歷史悠久，咸、辛，平，歸肝、肺、胃經，具有息風止痙、祛風止痛和化痰散結等功效。現代藥理研究表明，僵蠶具有抗凝、抗驚厥、抗癌和鎮靜催眠等作用。

僵蠶是常見的中藥動物藥，療效確實、藥用價值高，年需求量在400噸以上，且常年外銷出口。由于僵蠶的使用量較大，市面上出現了不少偽品或摻偽品，例如用石灰水將死家蠶摻白加工而成，或將綠僵菌感染致死的家蠶、黑死蠶等冒充正品使用，對僵蠶質量造成了不良影響，也給消費者帶來了不可忽視的安全隱患。因此，采用合適的技術鑒別僵蠶的真偽是很關鍵的問題。

近年來，有學者運用分子生物學技術開展了對僵蠶的鑒定研究，例如基于COI序列和ITS序列的DNA條形碼技術，主要利用動物基因組DNA提取試劑盒同時提取家蠶和白僵菌的DNA，然后分別擴增COI序列和ITS序列，并進行擴增產物測序，繼而建立NJ類聚樹分析，對鑒定同時含有動物和真菌的復合型藥材起到了一定效果。但是，在普通PCR技術利用DNA序列進行物種的鑒定過程中，由于采用了通用引物，因此在完成擴增后，需要進行產物測序并與基因數據庫比對，從而判斷種屬，步驟較多、耗時長、需要專門設備；此外，還無法實現對于摻偽品的檢識，或者由于摻偽現象而影響鑒定結果。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的問題，本發明針對僵蠶正品以及常見偽品的物種設計特異性引物，并提供了利用特異性引物擴增技術鑒別僵蠶的方法。

該法操作簡單、專屬性強、鑒別快速、無需測序，能準確直觀地鑒別僵蠶的真偽(包括摻偽)。本發明為僵蠶的專屬性鑒定提供一條新的途徑，有助于監控僵蠶藥材的質量，從而有利于保障臨床用藥的安全性、有效性，具有重要的應用價值。

本發明通過以下步驟達到快速鑒定僵蠶真偽的目的：

本發明首先提供一組鑒定僵蠶的特異性引物，所述引物為PBM-1或PBM-2和PBB-1或PBB-2；PBM-1上下游引物如SEQ.ID.NO.1和2所示，PBM-2上下游引物如SEQ.ID.NO.3和4所示；PBB-1上下游引物如SEQ.ID.NO.5和6所示，PBB-2上下游引物如SEQ.ID.NO.7和8所示。

進一步的，在上述特異性引物鑒定過程中，若受試樣品為完整的僵蠶且結果顯示為陽性，則判斷為正品僵蠶，若受試樣品經切片或粉碎，為非完整的僵蠶(如碎片、粉末)且結果顯示為陽性，則需進一步鑒定是否為摻偽品(含綠僵菌)。

所述鑒定僵蠶的特異性引物還包括引物PMA-1或PMA-2，PMA-1上下游引物如SEQ.ID.NO.9和10所示；PMA-2上下游引物如SEQ.ID.NO.11和12所示。

所述引物PBM-1或PBM-2均來自于家蠶(Bombyx mori)，PBB-1或PBB-2均來自于白僵菌(Beauveria bassiana)，并且引物PBM-1或PBM-2和PBB-1或PBB-2均能達到鑒定僵蠶的目的；引物PMA-1或PMA-2均來自于綠僵菌(Metarhizium anisopliae)，并且均能達到鑒定僵蠶中是否摻偽含綠僵菌的僵蠶的目的。