[發(fā)明專利]一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711483729.9
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108303476A
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王義;張鵬;金昌福;李寧飛
• 申請（專利權(quán)）人: 寧夏希望田野生物農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 賈澤純

一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法，它涉及一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法，該方法包括對照品溶液的制備、供試品溶液的制備，之后采用高效液相色譜法檢測，將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀中，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算林可霉素效價。本發(fā)明通過對色譜條件的優(yōu)選及供試品、標(biāo)準(zhǔn)品制備方法的試驗(yàn)，建立了菌渣中林可霉素的高效液相色譜檢測分析方法；通過對色譜條件和凈化工藝的優(yōu)化，建立了菌渣中林可霉素的檢測方法，通過方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)研究表明：所建立的方法準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性良好，能有效檢測菌渣中殘留林可霉素。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗生素的檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種菌渣中林可霉素殘留效價的檢測方法。

背景技術(shù)

目前抗生素類藥物應(yīng)用廣泛，主要應(yīng)用方式是作為獸藥，其檢測主要集中在動物源性食品中。主要的檢測方法有高效液相色譜法，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，毛細(xì)管電泳法，酶聯(lián)免疫法。

抗生素菌渣是發(fā)酵生產(chǎn)抗生素過程中的副產(chǎn)物，主要由發(fā)酵菌絲體、糖類、粗蛋白、少量未利用完全的無機(jī)鹽以及未提取完全的抗生素和其代謝產(chǎn)物組成。外觀呈豆腐渣樣，氣味因培養(yǎng)的菌類不同而異，含水率一般較高，堆積存放容易二次發(fā)酵產(chǎn)生臭味氣體。在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的過程中由于提取率低菌渣中殘留大量的林可霉素，而且極難降解，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，我國林可霉素年排放量約為數(shù)百萬噸，目前主要處理方式是占用土地堆放。林可霉素菌渣外觀呈土青色，含水率在70-85％之間，堆放處理不僅造成資源浪費(fèi)，而且經(jīng)雨水沖刷后還會污染土壤、地下水等生態(tài)環(huán)境。過去一直對菌渣采用干燥加工處理后作為飼料或飼料添加劑使用。但是，近期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌渣中殘留的抗生素會在動物體內(nèi)積累，人類食用此類動物源性食品會對身體造成危害。而且動物長期使用抗生素，會對其產(chǎn)生抗藥性，誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥細(xì)菌，破壞環(huán)境的微生態(tài)平衡。2008年中國將抗生素菌渣列入危險廢物的名單，抗生素菌渣未經(jīng)無害化處理嚴(yán)禁二次利用。建立穩(wěn)定、靈敏、高效的菌渣林可霉素殘留量檢測方法，為菌渣污染控制標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

抗生素在菌絲體殘留量的檢測在國外研究比較早，主要是檢測青霉素發(fā)酵中間產(chǎn)物中青霉素含量。目前國內(nèi)報道的檢測菌渣中林可霉素的方法是微生物培養(yǎng)法，此方法的靈敏度均較低，而且方法不完善，方法的準(zhǔn)確度和精密度以及檢出限均有待考量，不能滿足現(xiàn)代殘留檢測分析的要求。因此，準(zhǔn)確可靠的殘留檢測方法還有待探討。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中無法快速/準(zhǔn)確檢測林可霉素菌渣中林可霉素的缺陷，沒有一種有效解決基質(zhì)效應(yīng)的影響的問題，而提供一種林可霉素菌渣中林可霉素提取且測定殘留量的方法，以期為探明林可霉素菌渣中林可霉素的殘留及其轉(zhuǎn)化提供方法依據(jù)。

本發(fā)明的一種菌渣中林可霉素殘留量的檢測方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：

一、供試品樣品制備：

1)稱取含有林可霉素的菌渣，加入提取劑，渦旋振蕩1min，于超聲中輔助提取30min，以3000～4000rpm離心10min，取上清液；

2)稱取PSA、C₁₈和無水Na₂SO₄，渦旋混合1min后加入上一步的上清液，繼續(xù)渦旋1min，以4000rpm/min離心10min，收集上清液，得供試品溶液；

二、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

用甲醇將林可霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成質(zhì)量濃度為10.00mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、50mg/L、100.00mg/L、200.00mg/L和400mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；采用高效液相色譜法對上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行檢測，以測得峰面積作為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)；

三、測定：吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液和供試品溶液注入液相色譜儀中，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算林可霉素素殘留量；