[發(fā)明專利]判斷基因組中目標基因拷貝數(shù)的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711482313.5
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108103154A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李陽
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢艾德士生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 南京縱橫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林;徐瑛

本發(fā)明公開了判斷基因組中目標基因拷貝數(shù)的方法，用待測物種的基因組中一個已知拷貝數(shù)的基因作為內(nèi)參基因A；構(gòu)建一個基因片段ABm，其上含有相同拷貝數(shù)的A序列的突變片段Am和待檢測目標基因B的突變片段Bm；調(diào)整濃度使體系中A和ABm的摩爾比接近1:1的水平，構(gòu)建兩個體系的PCR反應(yīng)：分別用于擴增內(nèi)參基因A和A的突變片段Am，以及用于擴增目標基因B和B的突變片段Bm，分析兩個體系中A:Am的摩爾比值A(chǔ)n和B:Bm的摩爾比值Bn，則待檢測目標基因B的拷貝數(shù)N＝X*Bn/An。本發(fā)明通過加入內(nèi)參基因的方式，利用簡單的普通PCR技術(shù)，快速判斷目標基因的拷貝數(shù)，方法巧妙，抗干擾能力強，結(jié)果穩(wěn)定，成本低廉，分辨率高，是目標基因拷貝數(shù)鑒定的突破性方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及判斷基因組中目標基因拷貝數(shù)的方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因植物是擁有來自其他物種基因的植物,該基因變化過程現(xiàn)在一般是指通過重組DNA技術(shù)人工插入其他物種基因以創(chuàng)造出擁有新特性的植物，如使植株具有抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等新特性。

在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物中目標基因會隨機的插入植物基因組中，插入拷貝數(shù)和位點都是隨機的，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因中目標基因50％以上會以單拷貝的形式插入，而基因槍介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因中目標基因則以多基因拷貝插入為主，但是在后期的應(yīng)用和基因功能分析中，必須以單拷貝為實驗材料，以保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定可靠。所以，鑒定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)是轉(zhuǎn)基因后期分析的一項必須工作。

目前，分析拷貝數(shù)的權(quán)威方法有southern blot，其實驗技術(shù)要求高，成本高，放射性同位素危險性高，地高辛效果不理想；其他的方法有定量PCR，但是定量PCR方法并不準確，因為其最大差異分辨率至少需一倍以上，其結(jié)果的可信性不能達到100％。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種判斷基因組中目標基因拷貝數(shù)的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

判斷基因組中目標基因拷貝數(shù)的方法，用待測物種的基因組中一個已知拷貝數(shù)的基因作為內(nèi)參基因A，記為拷貝數(shù)為X的內(nèi)參基因A；

構(gòu)建一個基因片段ABm，其上含有相同拷貝數(shù)的內(nèi)參基因A序列的突變片段Am和待檢測目標基因B的突變片段Bm；

在PCR體系中加入基因組模板和ABm，調(diào)整濃度使體系中A和ABm的摩爾比接近1:1的水平，構(gòu)建兩個體系的PCR反應(yīng)：第一個體系中設(shè)計一對引物PA-F/PA-R用于擴增內(nèi)參基因A和A的突變片段Am，第二個體系中設(shè)計一對引物PB-F/PB-R用于擴增目標基因B和B的突變片段Bm，兩個體系中都用相同的混合的基因組和ABm片段的DNA作為模板，PA-F/PA-R的擴增產(chǎn)物為A/Am，PB-F/PB-R的擴增產(chǎn)物為B/Bm，分析兩個體系中A:Am的摩爾比值A(chǔ)n和B:Bm的摩爾比值Bn，則待檢測目標基因B的拷貝數(shù)N＝X*Bn/An。

進一步的，所述的基因片段ABm為一個參比載體ABm或一個DNA片段ABm。

優(yōu)選地，所述突變片段Am和突變片段Bm的四種堿基為均衡突變，突變位點數(shù)大于4個，且突變后的模板和突變前的模板具有相同的PCR擴增效率。

優(yōu)選地，所述使體系中A和ABm的摩爾比接近1:1的方法為：通過計算基因組的大小和基因組模板的濃度，以及ABm的濃度和ABm所在的分子大小計算得到。

優(yōu)選地，所述An和Bn的計算方法通過高通量測序或者一代測序方法得到。

優(yōu)選地，采用一代測序方法得到An和Bn值的方法為：將兩個PCR體系分別的擴增結(jié)果進行一代測序，將測序得到的峰值數(shù)據(jù)以及作為參比差異序列的同源序列一起提交給計算機程序進行比對，統(tǒng)計每個序列所有差異位點的平均強度，各序列平均信號強度的比值即代表了所述同源序列的數(shù)量比值；所述同源序列為A/Am序列或者B/Bm序列。