[發明專利]一種過表達glnR基因的耐銨固氮微生物及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201711481698.3
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108220216B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 陳三鳳;王天舒;趙喜云
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

1.一種過表達glnR基因的耐銨固氮微生物，其特征在于，在多粘類芽孢桿菌基因組的amyE位點整合來自多粘類芽孢桿菌的glnR基因，所述glnR基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.權利要求1所述的耐銨固氮微生物的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）利用引物glnR-amyE1和glnR-amyE2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因組為模板PCR擴增得到長1161 bp的amyE位點上游同源臂；

利用引物glnR-amyE5和glnR-amyE6，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因組為模板PCR擴增得到長1017bp的amyE位點下游同源臂；

利用引物glnR-amyE3和glnR-amyE4，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因組為模板PCR擴增得到長803 bp的片段；

用Tiangen膠回收試劑盒切膠回收以上3個片段；

（2）用BamHI和SalI酶切溫敏型質粒pRN5101，得到酶切片段；

（3）用New England Biolabs Gibson assembly master mix 將回收純化后的3個片段和酶切純化后的pRN5101組裝在一起，得到載體pROglnR；

（4）將載體pROglnR通過電擊轉化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受態細胞中，39℃傳代培養，先篩選得到具有紅霉素抗性的單交換菌株，再繼續傳代，從中篩選不再具有紅霉素抗性的菌株，經PCR驗證和測序確認得到同源雙交換后的glnR過表達菌株WT/glnR；

其中，所述引物glnR-amyE1、glnR-amyE2、glnR-amyE3、glnR-amyE4、glnR-amyE5和glnR-amyE6的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.2~7所示。

3.SEQ ID NO.1所示的glnR基因在提高多粘類芽孢桿菌在高銨條件下固氮酶活性方面的應用，其特征在于，通過在多粘類芽孢桿菌基因組的amyE位點整合來自多粘類芽孢桿菌的glnR基因，提高多粘類芽孢桿菌在高銨條件下固氮酶活性，所述高銨條件為多粘類芽孢桿菌所處環境中NH₄⁺的濃度為100mM。