[發(fā)明專利]一種過表達(dá)glnR基因的耐銨固氮微生物及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711481698.3
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108220216B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳三鳳;王天舒;趙喜云
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體公開了一種過表達(dá)glnR基因的耐銨固氮微生物及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。所述耐銨固氮微生物為在類芽孢桿菌屬菌株基因組的amyE位點(diǎn)整合來自多粘類芽孢桿菌的glnR基因，該耐銨固氮微生物在限銨和高銨條件下都能進(jìn)行生物固氮，提高了類芽孢桿菌屬微生物在高銨條件下的固氮酶活性，突破了高銨條件對生物固氮的抑制作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說，涉及一種過表達(dá)glnR基因的耐銨固氮微生物及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

氮素是植物生產(chǎn)中必需的最大元素。化學(xué)氮肥在保障我國糧食生產(chǎn)、蔬菜種植和果樹栽培中起著十分重要的作用。但長期過量偏施化學(xué)氮肥，導(dǎo)致土壤酸化和鹽漬化，土壤微生物活力下降，己成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要制約因子。

固氮微生物在常溫常壓下，利用體內(nèi)的固氮酶能將空氣中的氮?dú)膺€原成銨，供植物生長利用。但固氮效率受銨濃度的影響，即，在限銨或銨濃度低時固氮，銨濃度一般大于5mM以上抑制固氮。在貧瘠的土壤里，固氮微生物的固氮效率高，而在肥沃的土壤里，只生長但不固氮。因此，獲得在高銨條件下固氮的微生物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種過表達(dá)glnR基因的耐銨固氮微生物及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了一種過表達(dá)glnR基因的耐銨固氮微生物，在微生物菌株基因組的amyE位點(diǎn)整合來自多粘類芽孢桿菌的 glnR基因，所述glnR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步地，所述微生物為固氮類芽孢桿菌屬。

在本發(fā)明的具體實施方式中，采用多粘類芽孢桿菌作為代表，以說明本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建得到的突變株。

進(jìn)一步地，本發(fā)明以多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) 為例，提供了所述耐銨固氮微生物的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)利用引物glnR-amyE1和glnR-amyE2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因組為模板PCR擴(kuò)增得到長1161bp的amyE位點(diǎn)上游同源臂；

利用引物glnR-amyE5和glnR-amyE6，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因組為模板PCR擴(kuò)增得到長1017bp的amyE位點(diǎn)下游同源臂；

利用引物glnR-amyE3和glnR-amyE4，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因組為模板PCR擴(kuò)增得到長803bp的片段；

用Tiangen膠回收試劑盒切膠回收以上3個片段；

(2)用BamHI和SalI酶切溫敏型質(zhì)粒pRN5101，得到酶切片段；

(3)用Gibson assembly master mix(New England Biolabs)將回收純化后的3個片段和酶切純化后的pRN5101組裝在一起，得到載體 pROglnR；

(4)將載體pROglnR通過電擊轉(zhuǎn)化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受態(tài)細(xì)胞中，39℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)，先篩選得到具有紅霉素抗性的單交換菌株，再繼續(xù)傳代，從中篩選不再具有紅霉素抗性的菌株，經(jīng)PCR驗證和測序確認(rèn)得到同源雙交換后的glnR過表達(dá)菌株 WT/glnR；

其中，所述引物glnR-amyE1、glnR-amyE2、glnR-amyE3、 glnR-amyE4、glnR-amyE5和glnR-amyE6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～7所示。