[發(fā)明專利]用于肺癌相關(guān)基因SHOX2甲基化檢測的引物對(duì)、試劑盒及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711479687.1
• 申請(qǐng)日: 2017-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN107955836A
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓林志;肖芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 韓林志
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別的，涉及一種用于肺癌相關(guān)基因SHOX2甲基化檢測的引物對(duì)、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

肺癌是中國發(fā)病率首位的癌癥，雖然組織學(xué)活檢和細(xì)胞學(xué)檢測可以確診肺癌，但其檢出時(shí)病情多已處于較晚期，且檢出率并不理想。人矮小同源盒基因SHOX2的甲基化與肺癌密切相關(guān)，SHOX2基因甲基化檢測為解決這個(gè)問題提供了一個(gè)較為有效的選項(xiàng)，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證明其與組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢測聯(lián)合使用提高了確診率，是輔助確診肺癌的有效工具。

SHOX2基因是與肺癌密切相關(guān)的腫瘤抑制基因，其啟動(dòng)子部位CpG島甲基化是所述基因失活的主要機(jī)制之一。本發(fā)明通過分別檢測SHOX2基因啟動(dòng)子部位CpG島甲基化，可以在分子水平上較完善的評(píng)估患者的肺癌變和轉(zhuǎn)歸的實(shí)際情況，有效的指導(dǎo)治療。從而避免了現(xiàn)今肺癌治療的誤診和過治療，以及漏診。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基(-CH3)共價(jià)結(jié)合到DNA分子的胞嘧啶(C)堿基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，而并不改變DNA的序列。眾多研究表明，SHOX2基因啟動(dòng)子甲基化與肺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，它是肺癌特異的分子標(biāo)記。因此，檢測肺癌SHOX29基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，對(duì)肺癌的診斷、治療、預(yù)后判斷等方面具有重要意義。

目前，組織活檢對(duì)于患者而言具有較大的創(chuàng)傷，也會(huì)因?yàn)槟[瘤具有異質(zhì)性，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。痰液樣本相對(duì)組織樣本易獲得，且對(duì)患者無創(chuàng)。此外，傳統(tǒng)的甲基化檢測方法包括：甲基化特異性PCR及亞硫酸氫鹽測序法。然而這些方法存在操作繁瑣、準(zhǔn)確性低及敏感性不高的缺點(diǎn)，限制了其在臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用。

本發(fā)明采用熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，對(duì)病人血漿游離核酸SHOX2基因甲基化進(jìn)行檢測，通過對(duì)樣本進(jìn)行重亞硫酸鹽處理后，通過特異性引物和探針對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，以達(dá)到快速檢測SHOX2基因甲基化的目的，最終間接為人肺癌早期診斷提供有效信息，為人肺癌早發(fā)現(xiàn)早治療提供一種簡便易行的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述傳統(tǒng)甲基化檢測方法存在操作繁瑣、準(zhǔn)確性低及敏感性不高的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種操作簡單、準(zhǔn)確性高及敏感性高且基于熒光PCR技術(shù)的用于肺癌相關(guān)基因SHOX2甲基化檢測的引物對(duì)、試劑盒及其方法。

本發(fā)明提供了一種用于肺癌相關(guān)基因SHOX2甲基化檢測的引物對(duì)，包括針對(duì)SHOX2基因的啟動(dòng)子區(qū)和β-Actin內(nèi)參基因的特異性引物及探針，如下：

SHOX2正向引物：5'-TTTTGGATAGTTAGGTAATTTTYGTT-3'(SEQ ID NO.1)，

SHOX2反向引物：5'-ACGAACCCTTTAAACAACCAACATAA-3'(SEQ ID NO.2)，

SHOX2第一檢測探針：5'FAM-AAACGCCTATACTCGTACG-3'MGB(SEQ ID NO.3)；

SHOX2第二檢測探針：5'VIC-CGATCGAACAAACG-3'MGB(SEQ ID NO.4)；

β-Actin正向引物：5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'(SEQ ID NO.5)，

β-Actin反向引物：5'-CCAAACTATAACCTCTACAACCTTCAAAA-3'(SEQ ID NO.6)，

β-Actin檢測探針：5'ROX-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'MGB(SEQ ID NO.7)。

Y為兼并堿基，即Y＝C/T。

本發(fā)明還提供了一種用于肺癌相關(guān)基因SHOX2甲基化檢測的試劑盒，包括含有如上述引物及探針的PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括：SHOX2正向引物、SHOX2反向引物、SHOX2第一檢測探針、SHOX2第二檢測探針，β-Actin正向引物、β-Actin反向引物、β-Actin檢測探針，10×PCR buffer，dNTP及無核酸酶水。

在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述試劑盒還包括Ex Taq酶。

在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述PCR反應(yīng)液的成分終濃度為：1×PCR buffer，0.4μM SHOX2正向引物、0.4μM SHOX2反向引物、0.4μM SHOX2第一檢測探針、0.4μM SHOX2第二檢測探針，0.4μMβ-Actin正向引物、0.4μMβ-Actin反向引物、0.4μMβ-Actin檢測探針，0.25mM dNTP。