[發明專利]用于肺癌相關基因SHOX2甲基化檢測的引物對、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201711479687.1
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN107955836A
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發明（設計）人: 韓林志;肖芳
• 申請（專利權）人: 韓林志
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于肺癌相關基因SHOX2甲基化檢測的引物對，其特征在于，包括針對SHOX2基因的啟動子區和β-Actin內參基因的特異性引物及探針，如下：

SHOX2正向引物：5'-TTTTGGATAGTTAGGTAATTTTYGTT-3'，

SHOX2反向引物：5'-ACGAACCCTTTAAACAACCAACATAA-3'，

SHOX2第一檢測探針：5'FAM-AAACGCCTATACTCGTACG-3'MGB；

SHOX2第二檢測探針：5'VIC-CGATCGAACAAACG-3'MGB；

β-Actin正向引物：5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'，

β-Actin反向引物：5'-CCAAACTATAACCTCTACAACCTTCAAAA-3'，

β-Actin檢測探針：5'ROX-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'MGB。

2.一種用于肺癌相關基因SHOX2甲基化檢測的試劑盒，其特征在于，包括含有如權利要求1所述的特異性引物及探針的PCR反應液，所述PCR反應液包括：SHOX2正向引物、SHOX2反向引物、SHOX2第一檢測探針、SHOX2第二檢測探針，β-Actin正向引物、β-Actin反向引物、β-Actin檢測探針，10×PCR buffer，dNTP及無核酸酶水。

3.根據權利要求2所述的用于肺癌相關基因SHOX2甲基化檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括Ex Taq酶。

4.根據權利要求2所述的用于肺癌相關基因SHOX2甲基化檢測的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液的成分終濃度為：1×PCR buffer，0.4μM SHOX2正向引物、0.4μM SHOX2反向引物、0.4μM SHOX2第一檢測探針、0.4μM SHOX2第二檢測探針，0.4μMβ-Actin正向引物、0.4μMβ-Actin反向引物、0.4μMβ-Actin檢測探針，0.25mM dNTP。

5.根據權利要求2-4中任一所述的用于肺癌相關基因SHOX2甲基化檢測的試劑盒，其特征在于，還包括陽性對照品及陰性對照品，所述陽性對照品為SHOX2甲基化標準品DNA，所述陰性對照品為非甲基化標準品DNA。

6.一種用于肺癌相關基因SHOX2甲基化檢測的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：取待檢測樣本抽提的DNA，對其進行轉化處理，轉化后的DNA作為PCR的模板；

步驟二：提供如權利要求5所述的試劑盒，對所述模板進行PCR擴增；

步驟三：根據SHOX2與β-Actin基因PCR擴增結果的相對熒光CT值來確定待檢測樣本的甲基化率，即待檢測樣本中SHOX2/β-Actin的比值除以陽性對照品中SHOX2/β-Actin的比值。

7.根據權利要求6所述的用于肺癌相關基因SHOX2甲基化檢測的方法，其特征在于，所述步驟一中轉化處理所采用的試劑為亞硫酸氫鹽或重亞硫酸鹽。

8.根據權利要求7所述的用于肺癌相關基因SHOX2甲基化檢測的方法，其特征在于，所述步驟二中PCR擴增反應程序為：95℃變性5min；45cycles，95℃15sec，60℃30sec。