[發明專利]一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法

有效

• 申請號: 201711478650.7
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN109988858B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 董睿;劉劍;王維維;陳永芳;張麗;胡碩;萬強
• 申請（專利權）人: 貴州中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11;C12Q1/686
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張春水;唐京橋

本發明公開了一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法，包括Nr、Btc、CpTI、EPSPS、CMV?cp、PVY?cp、TMV?cp、CMV?sat、PVY?nib和TMV?54D基因的位點、引物、探針。本發明將煙草轉基因品系的內源和特定外源基因同時用于設計特異性的引物探針組，各引物探針不會造成相互干擾，僅能對特定目標序列進行擴增并激發熒光信號，對非目標序列無擴增和熒光信號，特異性好，檢測靈敏度高。

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，尤其涉及一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法。

背景技術

1983年，世界上首例轉基因作物也即是轉基因煙草在美國研發成功；1994年，美國Monsanto公司的延熟保鮮轉基因西紅柿在美國批準上市；數十年來，轉基因作物在世界范圍內廣泛應用，也引起了無數爭議。

我國發布的轉基因煙草的相關規范有國煙法[1998]168號《煙草基因工程研究及其應用管理辦法》、國煙科[2003]387號《國家煙草專賣局關于加強對轉基因煙草監控的通知》及在2005至2006年還陸續傳達了加強出口煙草轉基因檢測的幾個文件。由于煙草作為轉基因模式作物，研究最早、范圍較廣，因而在部分檢測機構抽檢中也有發現。目前PCR技術是檢測和鑒定轉基因產品的主流方法，通過在樣品DNA中檢測某外源基因，從而判定樣品是否含有該轉基因成分。

樣品中DNA的提取，從操作方式可分為自動化提取，如尚未普及的自檢工作站；半自動化提取，如已逐漸普及的核酸提取儀；手動提取，如當前常見的商品化試劑盒、自制試劑等。

種子和新鮮煙葉DNA損失小且較完整，上述三種方法均可適用，通常DNA純度OD260/OD280為1.6至1.8，濃度在ng/μL級，可略作稀釋或直接用于PCR檢測。

烤后煙葉和卷煙DNA損失大且碎片化，自動化、半自動化的方法得率較低；通常采用手動提取的方法。因為樣品種類、研究方式區別很大，手動提取的方法也種類廣泛、差異顯著，效果因而參差不齊。

第一代PCR技術，通常稱為普通PCR技術，先設計物種特異基因的引物，再將樣品DNA和引物及擴增試劑混勻后通過PCR儀對目的基因進行反復擴增，然后通過電泳對擴增產物進行鑒定，從而判定是否含有該物種源性成分。

第二代PCR技術為實時定量熒光PCR，通常簡稱熒光PCR。除了設計物種特異基因的引物外，再設計一條熒光探針。將樣品DNA、引物、探針及擴增試劑混勻后通過實時定量熒光PCR儀(通常簡稱熒光PCR儀)對目的基因進行反復擴增，探針的熒光信號累積與基因擴增同步，相對普通PCR，既提升了擴增時的特異性，擴增結束后也立即獲得檢測結果。

多重實時定量熒光PCR(以下簡稱多重熒光PCR)屬于熒光PCR的一種，針對多個物種特異基因，逐個設計引物和探針，不同探針分別標記上不同波長的熒光基團。將樣品DNA、引物、探針及擴增試劑混勻后通過多通道熒光PCR儀對多個目的基因進行反復擴增，通過監測多個熒光信號達到同時檢測多個目的基因的要求。相對普通熒光PCR，每增加一套引物和探針即可將檢測效率提升一倍、并將其他試劑成本降低一倍。

中國專利數據庫中涉及轉基因成分鑒定的PCR技術的專利申請件已有百余件，但多為普通PCR方法和熒光PCR方法，利用多重熒光PCR技術對煙草轉基因的研究在國內還是空白，因此，提供一種多重熒光PCR檢測煙草轉基因的方法是目前亟待解決的問題。

發明內容

本發明提供了一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法，其目的在于提供一種高效率，低成本，檢測結果準確的轉基因煙草的檢測方法。

其具體技術方案如下：

本發明選定的具體內源基因和外源基因包括：

(1)內源基因：Nr，英文名：Nicotiana?tabacum?nitrate?reductase；中文名：煙草硝化還原酶。