[發明專利]一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法

有效

• 申請號: 201711478650.7
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN109988858B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 董睿;劉劍;王維維;陳永芳;張麗;胡碩;萬強
• 申請（專利權）人: 貴州中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11;C12Q1/686
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張春水;唐京橋

1.一種檢測轉基因煙草多重熒光PCR的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：進行樣品處理，提取樣品DNA；

步驟2：建立轉基因煙草的多重熒光PCR引物探針的多重熒光PCR反應體系，反應條件為：95℃?20-120s或10-15min；95℃?5-60s，60℃?20-120s，40個循環，收集熒光信號；

步驟3：煙草轉基因成分檢測結果的判斷，包括：（1）質控標準：陽性對照的Nr、CaMV35S、NPT?II、NOS、Btc、CpTI、EPSPS、CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp、CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD均有熒光對數增長，且Ct值≤30.0，陰性對照和空白對照均無熒光信號和熒光對數增長，Ct值≥40.0，進行（2）的煙草成分檢測；

（2）煙草成分檢測：樣品Nr檢測陰性，表明該樣品中不含煙草DNA，或煙草DNA含量不足以進行轉基因成分檢測和判定；樣品Nr檢測陽性，表明該樣品中含有煙草DNA，進行（3）的轉基因成分判定；

（3）轉基因成分判定：CaMV35S或/和NPT?II或/和NOS檢測陰性，表明該樣品未檢出CaMV35S或/和NPT?II或/和NOS轉基因成分；CaMV35S或/和NPT?II或/和NOS檢測陽性，表明該樣品檢出CaMV35S或/和NPT?II或/和NOS轉基因成分，進行（4）的品系鑒定；

（4）品系鑒定：Btc或/和CpTI或/和EPSPS或/和CMV-cp或/和PVY-cp或/和TMV-cp或/和CMV-sat或/和PVY-Nib或/和TMV-54kD檢測陰性，表明該樣品不含有Btc或/和CpTI或/和EPSPS或/和CMV-cp或/和PVY-cp或/和TMV-cp或/和CMV-sat或/和PVY-Nib或/和TMV-54kD品系基因；Btc或/和CpTI或/和EPSPS或/和CMV-cp或/和PVY-cp或/和TMV-cp或/和CMV-sat或/和PVY-Nib或/和TMV-54kD檢測陽性，表明該樣品含有Btc或/和CpTI或/和EPSPS或/和CMV-cp或/和PVY-cp或/和TMV-cp或/和CMV-sat或/和PVY-Nib或/和TMV-54kD品系基因；

所述轉基因煙草選自種子、新鮮煙葉、烤后卷煙或卷煙；

所述轉基因煙草的多重熒光PCR引物包括：

針對轉基因煙草的多重熒光PCR基因位點的Nr基因的單重引物，CaMV35S、NPT?II、NOS基因的三重引物，Btc、CpTI、EPSPS基因的三重引物，CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp基因的三重引物，CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD基因的三重引物；

所述Nr基因的引物為：SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2；

所述CaMV35S基因的引物為：SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4；

所述NPT?II基因的引物為：SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6；

所述NOS基因的引物為：SEQ?ID?NO.7和SEQ?ID?NO.8；

所述Btc基因的引物為：SEQ?ID?NO.9和SEQ?ID?NO.10；

所述CpTI基因的引物為：SEQ?ID?NO.11和SEQ?ID?NO.12；

所述EPSPS基因的引物為：SEQ?ID?NO.13和SEQ?ID?NO.14；

所述CMV-cp基因的引物為：SEQ?ID?NO.15和SEQ?ID?NO.16；

所述PVY-cp基因的引物為：SEQ?ID?NO.17和SEQ?ID?NO.18；

所述TMV-cp基因的引物為：SEQ?ID?NO.19和SEQ?ID?NO.20；

所述CMV-sat基因的引物為：SEQ?ID?NO.21和SEQ?ID?NO.22；

所述PVY-Nib基因的引物為：SEQ?ID?NO.23和SEQ?ID?NO.24；

所述TMV-54kD基因的引物為：SEQ?ID?NO.25和SEQ?ID?NO.26；

轉基因煙草的多重熒光PCR基因位點，包括：

Nr基因位點:JN384020.1；

Btc基因位點:EU816953.1；

CpTI基因位點:AJ271752.1；

EPSPS基因位點:AY592954.1；

CMV-cp基因位點:KJ513406.1；

PVY-cp基因位點:KX376949.1；

TMV-cp基因位點:KJ508033.1；

CMV-sat基因位點:EF363687.1；

PVY-nib基因位點:EF470240.1；

TMV-54D基因位點:X66047.1；

所述轉基因煙草的多重熒光PCR探針包括Nr基因的單重探針，CaMV35S、NPT?II、NOS基因的三重探針，Btc、CpTI、EPSPS基因的三重探針，CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp基因的三重探針，CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD基因的三重探針；

所述Nr基因的探針為SEQ?ID?NO.27，熒光探針修飾為：5’-FAM，3’-MGB；

所述CaMV35S基因的探針為SEQ?ID?NO.28，熒光探針修飾為：5’-FAM，3’-MGB；

所述NPT?II基因的探針為SEQ?ID?NO.29，熒光探針修飾為：5’-HEX，3’-MGB；

所述NOS基因的探針為SEQ?ID?NO.30，熒光探針修飾為：5’-TAMRA，3’-MGB；

所述Btc基因的探針為SEQ?ID?NO.31，熒光探針修飾為：5’-FAM，3’-MGB；

所述CpTI基因的探針為SEQ?ID?NO.32，熒光探針修飾為：5’-HEX，3’-MGB；

所述EPSPS基因的探針為SEQ?ID?NO.33，熒光探針修飾為：5’-TAMRA，3’-MGB；

所述CMV-cp基因的探針為SEQ?ID?NO.34，熒光探針修飾為：5’-FAM，3’-MGB；

所述PVY-cp基因的探針為SEQ?ID?NO.35，熒光探針修飾為：5’-HEX，3’-MGB；

所述TMV-cp基因的探針為SEQ?ID?NO.36，熒光探針修飾為：5’-TAMRA，3’-MGB；

所述CMV-sat基因的探針為SEQ?ID?NO.37，熒光探針修飾為：5’-FAM，3’-MGB；

所述PVY-Nib基因的探針為SEQ?ID?NO.38，熒光探針修飾為：5’-?HEX，3’-MGB；

所述TMV-54kD基因的探針為SEQ?ID?NO.39，熒光探針修飾為：5’-TAMRA，3’-MGB。