[發明專利]一種甌江彩鯉的基因編輯與過表達操作方法

在審

• 申請號: 201711477506.1
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108192927A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 陳紅林;王軍;王成輝
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;A01K67/027
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 嚴晨;許亦琳

本發明涉及生物技術，特別是涉及一種甌江彩鯉的基因編輯與過表達操作方法。本發明提供一種甌江彩鯉的選育方法，包括：將適量的甌江彩鯉的精子與卵子混合，撒入水中；待卵子沉落、粘附至位于水中的培養容器中；取出培養容器，沖洗卵子，保持卵子位于適量的水中；去除未受精的卵子；將受精卵子注射用于抑制tyrp1基因的CRISPR cas9基因編輯系統和/或過表達ASIP基因的Tol2轉座系統；培育所得受精卵子；將培育所得幼魚進行篩選。本發明所提供的對經濟魚類—甌江彩鯉受精卵進行基因敲除與過表達試驗，首次在甌江彩鯉“大花”體色中對黑色素相關基因成功進行了敲除與過表達操作，繁育出甌江彩鯉四種體色類型的純系能夠將體色穩定遺傳給下一代。

技術領域

本發明涉及生物技術，特別是涉及一種甌江彩鯉的基因編輯與過表達操作方法。

背景技術

鯉(Cyprinus carpio)是全世界分布最為廣泛的淡水魚類之一，是全球的重要養殖對象。甌江彩鯉(C.carpio var.color)是鯉的一種體色變異群體，原分布于我國浙江省甌江流域，因其優美的體色以及上佳的口感而成為一種重要的經濟魚類。相比斑馬魚，甌江彩鯉的體色更加豐富多樣，由黑色、白色、紅色組合形成多種體色類型，是研究魚類體色遺傳的良好材料。本實驗室通過多年的選育工作，獲得了“全紅”、“粉玉”、“大花”、“粉花”等不同體色類型的甌江彩鯉選育系，遺傳背景清楚，為甌江彩鯉實施基因敲除與過表達等遺傳操作提供了極佳條件。基因敲除是20世紀80年代發展期的一項遺傳工程技術，通過基因敲除，可以了解目標基因的生物學功能。基因敲除經歷了從ZFNs、TALENS技術到目前的CRISPR/Cas9技術，其體系在不斷完善，特別是CRISPR/Cas9系統的基因敲除技術，當前稱為基因編輯技術，可以同時滿足高效率、高特異性、低價格的要求，應用廣泛，成為解析功能基因作用的重要分子生物學工具和當前生物育種的前沿技術。同基因敲除技術一樣，基因過表達技術也是研究基因功能過程中最為直觀直接的技術手段之一。1996年，Inagaki等在青鳉魚的基因組內發現了具有自主活性的Tol2轉座子，它可以在基因組內插入和切離，并能改變自身的DNA序列，具有溫度耐受性較廣、無染色體位置偏好性等特點，是目前脊椎動物轉基因中應用最為廣泛的轉座子。基因敲除與過表達技術廣泛應用于細胞和各種模式動物研究中，鯉科魚類在進化過程中出現基因組加倍現象，使其基因組中包含100條染色體，因而對其基因功能的研究更具挑戰性。應用基因編輯與過表達技術對鯉進行基因功能研究，具有時間短，作用快，目標明確等優勢。鯉科魚類相比其他硬骨魚類具有更多的體色類型，是研究魚類體色進化的良好材料。所以，對于甌江彩鯉多種體色類型的選育工作是研究魚類體色形成機制的重要環節。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種甌江彩鯉的基因編輯與過表達操作方法，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種甌江彩鯉的選育方法，包括：

1)將適量的甌江彩鯉(Cyprinus carpio var.color)的精子與卵子混合，撒入水中；

2)待卵子沉落、粘附至位于水中的培養容器中；

3)取出培養容器，沖洗卵子，保持卵子位于適量的水中；

4)去除未受精的卵子；

5)將受精卵子注射用于抑制tyrp1基因(LOC 109085040)的CRISPR cas9基因編輯系統和/或過表達ASIP基因(LOC109082435)的Tol2轉座系統；

6)培育所得受精卵子；

7)將培育所得幼魚進行篩選。

對培育所得的幼魚進行篩選后，即可獲得體色有所變化(例如，變淺或加深)的F0代。

在本發明一些實施方式中，所述甌江彩鯉為“大花”體色配套系。