[發明專利]一種甌江彩鯉的基因編輯與過表達操作方法

在審

• 申請號: 201711477506.1
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108192927A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 陳紅林;王軍;王成輝
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;A01K67/027
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 嚴晨;許亦琳

1.一種甌江彩鯉的選育方法，包括：

1)將適量的甌江彩鯉的精子與卵子混合，撒入水中；

2)待卵子沉落、粘附至位于水中的培養容器中；

3)取出培養容器，沖洗卵子，保持卵子位于適量的水中；

4)去除未受精的卵子；

5)將受精卵子注射用于抑制tyrp1基因的CRISPR cas9基因編輯系統和/或過表達ASIP基因的Tol2轉座系統；

6)培育所得受精卵子；

7)將培育所得幼魚進行篩選。

2.如權利要求1所述的選育方法，其特征在于，所述甌江彩鯉為“大花”體色配套系。

3.如權利要求1所述的選育方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述精子和/或卵子為純合的，水體的深度為≥30cm；

和/或，所述步驟3)中，取出培養容器時抖落未粘附的卵子，保持卵子位于適量的水中具體指將水漫過卵子。

4.如權利要求1所述的選育方法，其特征在于，所述步驟5)中，注射具體為顯微注射，注射過程中受精卵子所位于的水體的水溫為14-18℃，于受精卵子吸水膨脹期至一細胞末期進行注射。

5.如權利要求1所述的選育方法，其特征在于，所述步驟5)中，抑制tyrp1基因的CRISPRcas9基因編輯系統包括Cas9蛋白和gRNA，靶序列如SEQ ID No.1所示，所述gRNA的正向引物如SEQ ID No.2所示，所述gRNA的反向引物如SEQ ID No.3所示，所述Cas9蛋白的濃度為150-250ng/uL，gRNA的濃度為175-275ng/uL。

6.如權利要求1所述的選育方法，其特征在于，所述步驟5)中，過表達ASIP基因的Tol2轉座系統包括ASIP基因表達載體和轉座酶mRNA，所述ASIP基因表達載體由Tol2ET質粒構建，所述ASIP基因表達載體的濃度為50-150ng/ul，轉座酶mRNA的濃度為40-140ng/ul。

7.如權利要求1所述的選育方法，其特征在于，所述步驟5)中，抑制tyrp1基因的CRISPRcas9基因編輯系統和/或過表達ASIP基因的Tol2轉座系統的注射量為卵子面積的1/10-3/10。

8.如權利要求1所述的選育方法，其特征在于，所述步驟6)中，于斑馬魚養殖系統中培育所得受精卵子。

9.如權利要求1所述的選育方法，其特征在于，所述步驟6)中，養殖系統為循環水養殖系統，養殖系統的水體溫度為22-28℃。

10.用于調控tyrp1基因和/或ASIP基因表達的技術在甌江彩鯉選育中的用途。