[發明專利]一種glnA基因缺失的耐銨固氮微生物及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201711476764.8
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108048384B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 陳三鳳;趙喜云;王天舒
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12R1/12;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

本發明涉及微生物領域，具體公開了一種glnA基因缺失的耐銨固氮微生物及其構建方法與應用。所述glnA基因缺失的耐銨固氮微生物在無銨和有銨條件下都能進行生物固氮，提高了類芽孢桿菌屬微生物在高銨條件下的固氮酶活性，突破了高銨條件對生物固氮的抑制作用，在農業生產中具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及微生物領域，具體地說，涉及一種glnA基因缺失的耐銨固氮微生物及其構建方法與應用。

背景技術

氮素是植物生產中必需的最大元素?；瘜W氮肥在保障我國糧食生產、蔬菜種植和果樹栽培中起著十分重要的作用。但長期過量偏施化學氮肥，導致土壤酸化和鹽漬化，土壤微生物活力下降，己成為農業可持續發展的一個重要制約因子。

生物固氮是少數細菌，在常溫常壓下將空氣中的氮氣還原成銨的過程，固氮形成的銨被植物吸收利用。但生物固氮是一個高耗能過程，酶還原1分子氮，需要消耗16個ATP，因此生物固氮受產物銨的嚴格調控。銨濃度低(0-10mM)時，固氮菌進行生物固氮；銨濃度高(大于10mM)時，固氮菌只生長而不固氮。也就是說，固氮菌在貧瘠的土壤里固氮效率高，在肥沃的土壤里固氮效率低。突破銨的抑制作用，一直是生物固氮研究領域的一個研究熱點。獲得在高銨條件下固氮的微生物，在農業生產中具有重要的應用價值。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種glnA基因缺失的耐銨固氮微生物及其構建方法與應用。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

glnA基因幾乎存在于所有微生物中。glnA基因的產物谷氨酰胺合成酶,該酶催化谷氨酸和銨合成谷氨酰胺,谷氨酰胺為其它氨基酸的合成提供氨。

本發明首次通過研究發現，在固氮類芽孢桿菌中,有2個glnA基因：1個glnA基因與glnR連接在一起組成glnRA轉錄單元，另一個glnA基因(這里命名為glnA1基因)單獨存在。在高銨條件下，glnA基因(來自glnRA轉錄單元)的產物谷氨酰胺合成酶幫助GlnR與固氮基因簇上游的啟動子區的GlnR-binding site結合，抑制固氮基因的轉錄，進而抑制固氮酶活性。glnA基因缺失或，解除了對固氮酶活性的抑制作用。

基于前述研究發現，本發明提供了一種glnA基因缺失的耐銨固氮微生物，缺失如SEQ ID NO.1所示的glnA基因。

進一步地，所述微生物為固氮類芽孢桿菌屬。

在本發明的具體實施方式中，采用多粘類芽孢桿菌作為代表，以說明本發明構建方法構建得到的突變株。

進一步地，本發明以多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)為例，提供了所述耐銨固氮微生物的構建方法，包括如下步驟：

(1)利用SEQ ID NO.2～3所示的引物up(glnRA)-F/up(glnA)-R擴增glnA上游同源臂(1001bp)，利用SEQ ID NO.4～5所示的引物down(glnA)-F/down(glnA)-R擴增下游同源臂(511bp)；

(2)將載體pRN5101用BamHI/SalI限制性內切酶處理，得到酶切片段；

(3)利用Gibson assembly master mix(New England Biolabs)對步驟(1)所得的上游同源臂、下游同源臂和步驟(2)所得的酶切片段進行組裝，組裝后的重組質粒轉化固氮多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)；

(4)利用載體質粒pRN5101攜帶的紅霉素抗性篩選單交換菌株，通過多代培養后，再從中篩選不再具有紅霉素抗性的菌株，經PCR驗證和測序確認得到同源雙交換后glnA基因缺失后的突變株。