[發(fā)明專利]一種glnA基因缺失的耐銨固氮微生物及其構(gòu)建方法與應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201711476764.8 | 申請日： | 2017-12-29 |
| 公開（公告）號： | CN108048384B | 公開（公告）日： | 2021-04-27 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳三鳳;趙喜云;王天舒 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12R1/12;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;王璐 |
| 地址： | 100193 *** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 glna 基因 缺失 固氮 微生物 及其 構(gòu)建 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種glnA基因缺失的耐銨固氮微生物，其特征在于，缺失如SEQ ID NO.1所示的glnA基因；所述微生物為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。
2.權(quán)利要求1所述的耐銨固氮微生物的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)利用SEQ ID NO.2～3所示的引物up(glnRA)-F和up(glnA)-R擴增glnA上游同源臂，利用SEQ ID NO.4～5所示的引物down(glnA)-F和down(glnA)-R擴增下游同源臂；
(2)將載體pRN5101用BamHI/SalI限制性內(nèi)切酶處理，得到酶切片段；
(3)利用Gibson assembly master mix對步驟(1)所得的上游同源臂、下游同源臂和步驟(2)所得的酶切片段進行組裝，組裝后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化固氮多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa；
(4)利用載體質(zhì)粒pRN5101攜帶的紅霉素抗性篩選單交換菌株，通過多代培養(yǎng)后，再從中篩選不再具有紅霉素抗性的菌株，經(jīng)PCR驗證和測序確認得到同源雙交換后glnA基因缺失后的突變株。
3.一種提高多粘類芽孢桿菌在高銨條件下固氮酶活性的方法，其特征在于，通過使所述多粘類芽孢桿菌基因組DNA中的glnA基因缺失或不被表達，提高多粘類芽孢桿菌在高銨條件下固氮酶活性，所述glnA基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述高銨條件指多粘類芽孢桿菌所處環(huán)境中NH4+的濃度為100～400mM。
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