[發(fā)明專利]一種利拉魯肽的合成方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711476319.1
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN107903317A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 玄其存;王蔡典;李杰;肖英;周奕;趙呈青
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇諾泰澳賽諾生物制藥股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/605
• 分類號(hào): C07K14/605;C07K1/08;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 連云港潤知專利代理事務(wù)所32255
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種利拉魯肽的合成方法，其特征在于，其步驟如下：

(1) 固相合成利拉魯肽序列的第1-4位氨基酸作為第一片段，

(2) 固相合成利拉魯肽序列的第5-31位氨基酸，脫除20位Lys 的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并偶聯(lián)Pal-γ-Glu-Otbu，作為第二片段；

(3) 第一片段與第二片段液相偶聯(lián)，合成全保護(hù)利拉魯肽，經(jīng)裂解沉淀，得到利拉魯肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽的合成方法，其特征在于：步驟(1)中，第一片段與第二片段所用的樹脂為2- CTC樹脂。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽的合成方法，其特征在于：步驟(2)中，第二片段中20位Lys的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)選為催化氫化脫除的Alloc。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽的合成方法，其特征在于：步驟(1)與/或 (2)中，合成第一片段與第二片段的所用的縮合劑為DIC/HOBt，HBTU/HOBT/DIEA，PyBop/HOBT/DIEA其中的一種或多種；所用的反應(yīng)溶劑為DCM、DMF、NMP、DMSO中的一種或多種組合；所使用的Fmoc脫除試劑為v/v15%～25%哌啶/DMF溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽的合成方法，其特征在于：步驟(1)與/或 (2)中，第一片段、第二片段全保護(hù)裂解試劑為v/v15%～25%TFE/DCM或v/v0.05%～0.15%TFA/DCM。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽的合成方法，其特征在于：步驟(3)中第一片段與第二片段液相偶聯(lián)采用的縮合劑為DCC/HOSu組合或EDC·HCl/HOSU組合。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽的合成方法，其特征在于：步驟(3)采用的裂解試劑為TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:4～6:2～4:1～3。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽的合成方法，其特征在于：步驟(3)采用的裂解試劑為TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利拉魯肽的合成方法，其特征在于，其具體步驟如下：

（1）Fmoc-Gly-2-CTC樹脂的制備：

2-CTC樹脂加入到固相反應(yīng)器中，加入適量 DCM溶脹樹脂；抽干溶劑，加入Fmoc-Gly-OH，DIEA，DMF溶液，攪拌反應(yīng)；抽干溶劑，加入甲醇/DCM溶液，封閉；DCM與甲醇交替洗滌若干次；真空干燥后，得到Fmoc-Gly-2-CTC樹脂；

（2）多肽片段1的制備：

取Fmoc-Gly-2-CTC樹脂，加入到固相反應(yīng)器中，加入DCM溶脹樹脂；抽干溶劑，加入哌啶/DMF溶液，反應(yīng)；抽干溶劑，加入DMF洗滌；茚檢結(jié)果呈陽性；

取Fmoc-Glu(otbu)-OH，HOBt，DIC，加入DMF溶解，冰浴活化，將活化后的溶液加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)，茚檢檢測結(jié)果呈陰性后，抽干溶劑；加入DMF洗滌；

重復(fù)以上步驟，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；偶聯(lián)結(jié)束后，DCM與甲醇交替洗滌，真空干燥，得到肽樹脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC；

將肽樹脂Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-2-CTC加入到TFE/DCM中，反應(yīng)；收集濾液，濾液進(jìn)行真空旋干；得到Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH即為多肽片段1；

（3）多肽片段1-琥珀酰亞胺酯的制備：

Boc-His(Trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-OH加入到DCM溶解，加入DCC，HOSU，冰浴條件下反應(yīng)，TLC監(jiān)測原料多肽片段1反應(yīng)完全消失；反應(yīng)液用純水、飽和氯化鈉溶液洗滌，過濾除去不溶物，濾液加入無水硫酸鈉干燥；所得濾液即為多肽片段1-琥珀酰亞胺酯；

（4）多肽片段2的制備：

取Fmoc-Gly-2-CTC樹脂，加入到固相反應(yīng)器中，加入DCM溶脹樹脂，抽干溶劑，加入哌啶/DMF溶液，反應(yīng)；抽干溶劑，加入DMF洗滌；茚檢結(jié)果呈陽性；

稱取Fmoc-Arg(Pbf)-OH ，HOBt，DIC，加入DMF溶解，冰浴活化；將活化后的溶液加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)，茚檢檢測結(jié)果呈陰性后，抽干溶劑；加入DMF洗滌；

重復(fù)以上步驟，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；

取四三苯基膦鈀，嗎啡啉，THF加入到固相反應(yīng)器中，反應(yīng)，DMF洗滌，茚檢結(jié)果呈陽性；

取PPal-γ-Glu-Otbu，HOBt，DIC加入DMF溶解，冰浴活化5min；將活化后的溶液加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)，茚檢檢測結(jié)果呈陰性后，抽干溶劑；加入DMF洗滌；抽干溶劑，加入哌啶/DMF溶液，反應(yīng)，抽干溶劑，加入DMF洗滌；茚檢結(jié)果呈陽性，DCM與甲醇交替洗滌，真空干燥，所得樹脂即為肽樹脂2；

將肽樹脂2加入到TFE/DCM中，反應(yīng)，收集濾液，濾液進(jìn)行真空旋干；旋干后固體即為多肽片段2；

（5）全保護(hù)肽的制備：

將多肽片段1-琥珀酰亞胺酯的DCM溶液加入到多肽片段2的DCM溶液中，冰浴條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液旋干，所得產(chǎn)品即為利拉魯肽的全保護(hù)肽；

（6）裂解：

配制裂解試劑為TFA:Thioanisole:Anisole:EDT=90:5:3:2，冰浴條件下加入到全保護(hù)肽中，恢復(fù)至室溫繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入無水乙醚沉淀，離心沉淀；干燥后所得產(chǎn)品即為利拉魯肽粗肽。