[發明專利]構建細胞全轉錄本擴增產物的方法及其應用

有效

• 申請號: 201711475632.3
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN109988825B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 郭琦;王秀莉;董超;李長平;盧孟孟;宋廷瑞
• 申請（專利權）人: 杭州蓮和醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;G01N33/574;G01N33/569
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

本發明提出了一種構建細胞全轉錄本擴增產物的方法。該方法包括：將細胞樣品進行磁珠捕獲處理，以便獲得待處理細胞；以及將所述待處理細胞進行單細胞全轉錄本擴增，以便獲得所述待處理細胞的全轉錄本擴增產物，其中，進行單細胞全轉錄本擴增之前，進一步包括將所述待處理細胞進行裂解處理，所述裂解處理是通過向所述待處理細胞中加入PBS和裂解液進行的，基于1～100個待處理細胞，所述PBS的用量為7微升，所述裂解液的用量為4微升，所述裂解液包括100mM Tris?HCl、500mM KCl、25mM MgCl₂、10％NP40、0.1M DTT、RNA酶抑制劑(40U/μl)、0.5μM UP1引物、2.5mM dNTP以及無核酸酶水。該方法將磁珠捕獲技術與單細胞全轉錄本擴增技術巧妙相結合，嚴格控制待處理細胞與裂解液和PBS的加入量，可穩定獲得微量細胞(如循環腫瘤細胞)全轉錄本擴增產物。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及構建細胞全轉錄本擴增產物的方法及其應用，更具體地，本發明涉及構建細胞全轉錄本擴增產物的方法、檢測細胞中預定因子的方法、檢測細胞中預定因子的系統以及檢測前列腺癌循環腫瘤細胞中AR-V7的試劑盒。

背景技術

前列腺癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內其發病率居男性惡性腫瘤的第2位，死亡率居第5位。近十年來，隨著我國人口老齡化和生活方式的改變，前列腺癌的發病率和死亡率呈明顯的逐年上升趨勢。

雄激素受體(AR)在前列腺癌的發生、發展中起著重要作用，其通過調節下游基因的表達，促進前列腺癌的進展和轉移。晚期前列腺癌的治療方法主要是內分泌治療，即雄激素剝奪治療(ADT)。但在前列腺癌的治療過程中，常常對其產生耐藥，并發展成為去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)。在CRPC中盡管雄激素水平被抑制，但AR信號通路在CRPC中仍起著至關重要的作用。AR-V7(androgen receptor splice variant 7)是AR-Vs(androgen receptorsplice variants)中的一種，結構類似于AR，但缺乏配體結合域，可以不依賴雄激素而持續地活化。

Antonarakis等人探討了循環腫瘤細胞(CTC)中AR-V7的表達和CRPC患者對AR靶向療法的藥物恩雜魯胺或阿比特龍治療反應之間的相關性。研究結果顯示，恩雜魯胺治療組39％的患者和阿比特龍組19％的患者出現循環腫瘤細胞中AR-V7陽性。恩雜魯胺組AR-V7陽性患者與陰性患者相比，PSA(前列腺特異抗原)反應率明顯降低(0％VS 53％，P＝0.004)，PSA無進展生存時間(1.4個月VS 6個月，P＜0.001)，臨床或影像學無進展生存時間(2.1個月VS 6.1個月)和總體生存時間都明顯縮短；阿比特龍組也出現相似的結果(AntonarakisES,Lu C,Wang H,et al.AR-V7and resistance to enzalutamide and abiraterone inprostate cancer[J].N Engl J Med.2014,371(11):1028-1038.)。這說明AR-V7參與了恩雜魯胺和阿比特龍耐藥性的發展。目前已有大量研究證明，對前列腺癌循環腫瘤細胞AR-V7的檢測可以對CRPC患者中AR靶向療法的耐藥性進行評估。

因此，如何快速、準確地檢測前列腺癌患者中循環腫瘤細胞(CTC)中的AR-V7，是指導前列腺癌患者用藥的關鍵問題。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。