[發明專利]構建細胞全轉錄本擴增產物的方法及其應用

有效

• 申請號: 201711475632.3
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN109988825B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 郭琦;王秀莉;董超;李長平;盧孟孟;宋廷瑞
• 申請（專利權）人: 杭州蓮和醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;G01N33/574;G01N33/569
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

1.一種構建細胞全轉錄本擴增產物的方法，其特征在于，包括：

將細胞樣品進行磁珠捕獲處理，以便獲得待處理細胞；以及

將所述待處理細胞進行單細胞全轉錄本擴增，以便獲得所述待處理細胞的全轉錄本擴增產物，其中，進行單細胞全轉錄本擴增之前，進一步包括將所述待處理細胞進行裂解處理，所述裂解處理是通過向所述待處理細胞中加入PBS和裂解液進行的，基于1～100個待處理細胞，所述PBS的用量為7微升，所述裂解液的用量為4微升，所述裂解液包括100mM Tris-HCl、500mM KCl、25mM MgCl₂、10％NP40、0.1M DTT、40U/μl的RNA酶抑制劑、0.5μM UP1引物、2.5mM dNTP以及無核酸酶水。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞樣品來源于外周血；

任選地，所述外周血為腫瘤患者外周血；

任選地，所述待處理細胞為循環腫瘤細胞；

任選地，所述裂解處理包括用移液器對所述待處理細胞進行吸打重懸處理至少5次。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述磁珠捕獲處理是通過如下方式進行的：

1)將5mL外周血與100μL磁珠進行第一混合，所述磁珠預先利用PBS進行第一重懸處理，所述第一混合是在5rpm的條件下進行30min；

2)將所述第一混合產物在磁力架上靜置3min，以便除去第一上清；

3)將步驟2)所得沉淀進行第二重懸處理，所述第二重懸處理是在5ml PBS中進行的；

4)將第二重懸處理產物在磁力架上靜置1min，以便除去第二上清；

5)重復步驟3)和4)兩次；

6)將步驟5)所得沉淀進行第三重懸處理，所述第三重懸處理是在1ml PBS中進行的；

7)將第三重懸處理產物在磁力架上靜置1分鐘，以便獲得所述循環腫瘤細胞；

其中，所述磁珠包被有識別所述循環腫瘤細胞的抗體；

任選地，所述抗體包括EpCAM、Her2的至少之一。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述單細胞全轉錄本擴增是通過如下方式獲得的：

1)將循環腫瘤細胞在24℃的條件下進行裂解5分鐘，隨后在95℃的條件下裂解3分鐘，冷卻至4℃；

2)將步驟1)獲得的裂解產物在磁力架上靜置1分鐘，吸取第三上清；

3)將步驟2)所獲得第三上清與2μl gDNA Wipeout Buffer進行混合，所述混合是在42℃的條件下進行10分鐘；

4)將步驟3)所獲得產物與6μl Quantiscript RT mix進行混合，所述混合是在42℃的條件下進行60分鐘；

5)將步驟4)所得產物在95℃的條件下孵育3分鐘，放冰上冷置；

6)在步驟5)所得產物與10μl的ligation mix混合，所述混合是在24℃條件下進行30分鐘；

7)將步驟6)所得產物在95℃條件下靜置5分鐘，放冰上冷置；

8)將步驟7)所得產物與30μl的REPLI-g SensiPhi amplification mix進行混合，所述混合是在30℃條件下進行2h；

9)將步驟8)所得產物在65℃的條件下孵育5分鐘；

10)將步驟9)所得產物進行純化處理，以便獲得所述循環腫瘤細胞基因組全轉錄本擴增產物。

5.一種檢測細胞中預定因子的方法，所述方法用于非疾病診斷或治療目的，其特征在于，包括：

按照權利要求1～4任一項所述的方法構建細胞全轉錄本擴增產物；以及

基于所述全轉錄本擴增產物進行針對預定因子的PCR擴增，以便檢測所述細胞中預定因子。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述細胞為前列腺癌循環腫瘤細胞；

任選地，所述預定因子為AR-V7。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增為ddPCR擴增，ddPCR引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:1～2所示。