[發(fā)明專利]一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法

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• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108220329A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設計）人: 陳克貴;彭梅芳;范曉麗
• 申請（專利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)核技術(shù)研究所;成都億農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 廖慧敏

本發(fā)明公開了一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法，解決了現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因植物普遍存在的選擇標記基因潮霉素抗性基因的去除問題。從而在技術(shù)上解決了再次轉(zhuǎn)基因選擇標記基因難找的問題，而且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，也排除了潮霉素抗性基因存在于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中不利于人體健康的問題、以及潮霉素抗性基因植物對生態(tài)環(huán)境存在潛在危害的問題。本發(fā)明利用CRISPR/Cas9技術(shù)原理構(gòu)建潮霉素基因編輯載體，載體質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化植物。依轉(zhuǎn)化植株的不同，獲得的轉(zhuǎn)基因植株通過雜交或/和自交后，篩選得到潮霉素抗性基因敲除、并且不含有用于編輯潮霉素抗性基因所轉(zhuǎn)入植株的Cas9基因等外源DNA的植株。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法。

背景技術(shù)

在植物轉(zhuǎn)基因研究中，通常是將目標基因(Gene of Interest,GOI)與位于同一載體的選擇標記基因(Selectable Marker Gene,SMG)，一起轉(zhuǎn)入植物細胞，通過對SMG的篩選獲得含有GOI的轉(zhuǎn)化細胞。該轉(zhuǎn)化細胞再生形成植物，通過進一步對GOI的確認，從而獲得需要的轉(zhuǎn)基因植株。

這種轉(zhuǎn)基因植物就帶有SMG，通常是耐抗生素或除草劑抗性基因，如卡那霉素抗性基因(nptII基因)、潮霉素抗性基因(hpt基因)或除草劑抗性基因(bar基因)。SMG不僅對農(nóng)作物生長沒有任何必要，往往也可能會對細胞的發(fā)育和分化產(chǎn)生負面的影響；而且當一個轉(zhuǎn)基因植物中已含有一個SMG，在導入第二個GOI時，要選用不同的SMG，而實際中往往需要轉(zhuǎn)入多個基因來改良農(nóng)作物性狀，但能夠被運用的SMG數(shù)量是有限的，因此，存在于轉(zhuǎn)基因植株基因組中的SMG對多個GOI導入造成困難。

況且，SMG在收獲的農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，也有可能對人畜等食物鏈下游生物產(chǎn)生不良影響，特別是對人體健康可能存在著潛在危害，是普通大眾擔憂轉(zhuǎn)基因食品安全的重要因素；此外，帶有SMG的轉(zhuǎn)基因作物在田間的大量種植，這些基因轉(zhuǎn)移到其它生物中的可能性也是存在的，從而會對整個生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生極其嚴重的后果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase,hpt)的方法。將轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因敲除，在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域為轉(zhuǎn)入多個目標基因提供條件，并且也使得轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)業(yè)上應用更加安全。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法，包括：

1)基于CRISPR/Cas9技術(shù)原理，依據(jù)潮霉素抗性基因DNA序列SEQ No.1確定sgRNA目標序列，潮霉素抗性基因DNA序列編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列SEQ No.2所示；

依據(jù)上述步驟確定的目標序列設計出相應的PCR引物，并采用重疊延伸PCR方法構(gòu)建sgRNA表達盒，轉(zhuǎn)錄sgRNA的啟動子的選擇及編輯載體的選擇依植物確定；

2)將上述步驟1)得到的sgRNA表達盒連接到基因編輯載體，編輯載體的選擇依植物確定；

3)將上述步驟2)獲得的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中；

4)采用農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化植株，通過植株的雜交或/和自交后篩選獲得潮霉素抗性基因敲除、并且不含有用于編輯潮霉素抗性基因所轉(zhuǎn)入植株的外源DNA的植株。

其中一種途徑：用上述步驟4)中采用農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化野生型植株，通過植株的雜交和自交后篩選出植株的方法為：