[發(fā)明專利]一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711472842.7
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108220329A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳克貴;彭梅芳;范曉麗
• 申請（專利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所;成都億農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 成都行之專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51220
• 代理人: 廖慧敏

1.一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，包括：

1)、根據(jù)潮霉素抗性基因DNA序列，設(shè)計(jì)并構(gòu)建一個或多個sgRNA表達(dá)盒；

2)、將一個或多個sgRNA表達(dá)盒克隆到編輯載體上；

3)、將克隆得到的編輯載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中；

4)、采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化植株，通過植株的雜交或/和自交后，篩選獲得潮霉素抗性基因敲除、并且不含用于編輯潮霉素抗性基因所轉(zhuǎn)入植株的外源DNA的植株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化植株，通過植株的雜交和自交后篩選出植株的方法為：

采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株的方法，將編輯潮霉素抗性基因的DNA片段轉(zhuǎn)入野生型植株，得到編輯潮霉素抗性基因的轉(zhuǎn)基因植株；將得到的編輯潮霉素抗性基因的植株與要含有潮霉素抗性基因的植株進(jìn)行雜交，得到雜交種F1，F(xiàn)1代自交獲得F2代植株，在F2代植株中篩選出潮霉素抗性基因敲除、并且不含用于編輯潮霉素抗性基因所轉(zhuǎn)入植株的外源DNA的植株；

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化含有潮霉素抗性基因的植株，通過植株的自交后篩選出植株的方法為：

采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株的方法，將編輯潮霉素抗性基因的DNA片段直接轉(zhuǎn)入含有潮霉素抗性基因的植株，該轉(zhuǎn)基因植株自交，在自交后代中篩選出潮霉素抗性基因敲除、并且不含有用于編輯潮霉素抗性基因所轉(zhuǎn)入植株的外源DNA的植株。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，所述sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建方法包括：

第一步，依據(jù)潮霉素抗性基因DNA序列設(shè)計(jì)一個或多個sgRNA目標(biāo)序列；

第二步，根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)構(gòu)建sgRNA表達(dá)盒的PCR引物；

第三步，采用重疊延伸PCR擴(kuò)增得到sgRNA的DNA片段。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，所述植株為水稻。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，sgRNA表達(dá)盒的sgRNA目標(biāo)序列為：

sgRNA-1：5’-CTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3’，

sgRNA-2：5’-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGG-3’；

依據(jù)上述兩種sgRNA目標(biāo)序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建獲得的兩個sgRNA表達(dá)盒與編輯載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-B連接，得到的編輯載體質(zhì)粒PMF117。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，通過分子檢測在F1代植株中篩選出發(fā)生潮霉素抗性基因缺失植株。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，F(xiàn)2代植株通過分子檢測，篩選出發(fā)生潮霉素抗性基因敲除、且不含有編輯潮霉素抗性基因所轉(zhuǎn)入水稻植株的外源DNA的植株。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種敲除轉(zhuǎn)基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，帶有編輯潮霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的轉(zhuǎn)基因植株自交，在自交后代中經(jīng)分子檢測，篩選出發(fā)生潮霉素抗性基因敲除、且不含有編輯潮霉素抗性基因所轉(zhuǎn)入水稻植株的外源DNA的植株。