[發明專利]一種源自酪蛋白的抗氧化生物活性多肽MPFPK及其應用

在審

• 申請號: 201711469840.2
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN108129562A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 戴智勇;李博;鄔娜;劉苗;張巖春;董玲
• 申請（專利權）人: 澳優乳業（中國）有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/18;C12P21/06;A23L33/18;A61K38/17;A61P39/06
• 代理公司: 長沙明新專利代理事務所(普通合伙) 43222
• 代理人: 徐新

1.一種源自酪蛋白的抗氧化生物活性多肽MPFPK，其特征在于，由以下步驟制備而成：

1)酶法制備酪蛋白抗氧化肽：采用堿性蛋白酶酶解酪蛋白，酶解液離心，取上清液旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥存于-80℃備用，得到生物活性肽粗提取物；

2)離子交換法分離抗氧化肽：采用Sephadex C-25陽離子交換柱對步驟1)的復溶液進行分離，收集不同峰下不同組分的樣品，脫鹽處理后，再次旋轉蒸發濃縮并冷凍干燥存于-80℃備用；

3)分子量分布測定：采用HPLC法測定不同酪蛋白抗氧化組分的分子量；

4)氨基酸組成分析：采用HPLC-異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生方法測定不同酪蛋白抗氧化組分的氨基酸組成；

5)不同電荷性質肽組分抗氧化活性的測定：分別用TEAC法、ORAC法、測定抑制LDL氧化能力測定不同組分的抗氧化能力；

6)驗證酪蛋白肽組分對LDL氧化及荷脂細胞膽固醇含量的影響：通過建立巨噬細胞誘導建立LDL氧化模型并對模型今昔染色和進一步分析。

2.根據權利要求1所述的源自酪蛋白的抗氧化生物活性多肽MPFPK，其特征在于，步驟1)中，底物濃度為4～7％(w/v，單位為kg/L)，酶與底物比1.5～2.5％(w/w，單位為kg/kg)，反應在恒溫水浴箱中進行，設定酶解溫度為55～65℃，酶解時間為3～5h，控制酶解過程的pH為7.5～8.5；酶解結束后，立即煮沸滅酶，室溫冷卻后調節溶液pH至7.0。

3.根據權利要求1或2所述的源自酪蛋白的抗氧化生物活性多肽MPFPK，其特征在于，步驟2)中，所用流動相為醋酸緩沖液，流速為2.0mL/min，進樣量為500mg。

4.根據權利要求1或2所述的源自酪蛋白的抗氧化生物活性多肽MPFPK，其特征在于，步驟3)中，采用的分析柱為TSK gel G2000SWXL，流動相為0.1％TFA+45％乙腈溶液，流速為0.5ml/min，檢測波長214nm，時間30min，樣品濃度為2mg/mL；標品aprotini、bactutracin、WPWW、NCS、Gly-Ser的洗脫時間對log分子量作圖得到標準曲線y＝-0.1881x+6.5867，R2＝0.9954，y：logMW，x：洗脫時間。

5.根據權利要求1或2所述的源自酪蛋白的抗氧化生物活性多肽MPFPK，其特征在于，步驟4)中，柱前衍生法中，將100μL異硫氰酸苯酯和100μL三乙胺與200μL樣品混合于包錫箔紙的離心觀眾，渦旋震蕩充分混勻，放置于室溫黑暗條件下反應1h；反應結束后，向其中加入400μL正己烷，渦旋混合震蕩1min，靜置10min；HPLC分析條件為：A為磷酸緩沖溶液；B為色譜級乙腈；流速1mL/min，檢測波長為254nm，進樣量：10μL。

6.一種如權利要求1-5任一權利要求所述的源自酪蛋白的抗氧化生物活性多肽MPFPK在制備抗氧化或/和抑制LDL氧化和泡沫細胞形成的食品、保健品及藥物中的應用。