[發(fā)明專利]一種檢測NT-proBNP的試紙條及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711465237.7
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN108226468A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫宏浩;趙曉雙
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/533
• 分類號(hào): G01N33/533;G01N33/543;G01N33/558
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發(fā)明公開了一種檢測NT?proBNP的試紙條及其制備方法與應(yīng)用，屬于生物檢測領(lǐng)域。本發(fā)明試紙條主要由組裝在底板上的樣品墊、結(jié)合墊、含有檢測線T和控制線C的硝酸纖維素膜、吸收墊組成；結(jié)合墊固定有抗體5B6標(biāo)記熒光微球和生物素化抗體15F11；檢測線T包被有鏈霉親和素，控制線C包被有羊抗鼠IgG。通過制備結(jié)合墊、硝酸纖維素膜，將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次相互搭接粘貼于底板上組裝起來，切割得到試紙條。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)快速檢測方法所具備的靈敏度低、準(zhǔn)確性差的缺點(diǎn)，能夠在較短時(shí)間對(duì)微量NT?proBNP實(shí)現(xiàn)快速捕獲，不僅使得檢測限度降低，且大大提高了檢測的靈敏度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測NT-proBNP的試紙條及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

NT-proBNP是由腦鈉肽原(pro-BNP)經(jīng)內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的一種無活性的N端多肽片段，主要存在于心肌細(xì)胞對(duì)心室壁的張力或局部缺血作出應(yīng)答所產(chǎn)生的分泌物中。大量研究表明：NT-proBNP半衰期較長，穩(wěn)定性強(qiáng)，可作為心力衰竭診斷測試的主要指標(biāo)，在疾病診斷及預(yù)后評(píng)估階段具有重要作用。現(xiàn)如今定量檢測NT-proBNP的方法主要有：放射性免疫檢測技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定、電化學(xué)發(fā)光免疫分析及熒光免疫層析技術(shù)。放射性免疫檢測技術(shù)成本較低，但存在潛在的放射污染可能，且試劑具有半衰期，逐漸被非放射標(biāo)記免疫測定技術(shù)所取代。酶聯(lián)免疫吸附測定操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且準(zhǔn)確性和靈敏度較低。電化學(xué)發(fā)光免疫分析廣泛應(yīng)用于定量檢測NT-proBNP，其中，羅氏(Roche)Elecsys電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)最具代表性，但該分析方法需要大量樣本才能降低成本，不適用于中小型機(jī)構(gòu)及個(gè)人對(duì)NT-proBNP的定量和快速檢測。免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)90年代興起的一種基于層析技術(shù)和抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。目前，免疫層析技術(shù)發(fā)展為多種不同類型，較為常用的是雙抗體/抗原夾心法。在NT-proBNP免疫層析檢測中，由于T線抗體和抗原-熒光微球復(fù)合體僅有15s的作用時(shí)間，NT-proBNP的有效檢測限需要到20pg/mL。在抗原濃度低、反應(yīng)時(shí)間極短的條件下，單一的免疫層析技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度NT-proBNP的準(zhǔn)確檢測。

目前，基于現(xiàn)有免疫層析原理進(jìn)而提高檢測靈敏度的研究受到人們的廣泛關(guān)注。生物素和鏈霉親和素之間具有高度特異性親和力以及多級(jí)放大效應(yīng)，可大大提高免疫結(jié)合和示蹤分析的靈敏度。采用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)與熒光免疫層析技術(shù)相結(jié)合的方法，以期實(shí)現(xiàn)簡便、快速、靈敏檢測NT-proBNP。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在缺點(diǎn)與不足，提供一種以雙抗體夾心原理為基礎(chǔ)的新型檢測NT-proBNP的試紙條及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種檢測NT-proBNP的試紙條，主要由組裝在底板上的樣品墊、結(jié)合墊、含有檢測線T和控制線C的硝酸纖維素膜(NC膜)、吸收墊組成。其中，結(jié)合墊固定有抗體5B6標(biāo)記熒光微球和生物素化抗體15F11；檢測線T包被有鏈霉親和素，控制線C包被有羊抗鼠IgG。

所述的檢測NT-proBNP的試紙條的制備方法，包括如下步驟：

(1)將抗體5B6標(biāo)記的熒光微球和生物素化抗體15F11固定到結(jié)合墊上；

(2)在硝酸纖維素膜上分別劃T線、C線包被鏈霉親和素、羊抗鼠IgG；

(3)將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次相互搭接粘貼于底板上組裝起來，切割得到試紙條。

優(yōu)選的，所述的檢測NT-proBNP的試紙條的制備方法，包括如下步驟：

(1)使用1mL含1％Tween-20的0.01mol/L PBS浸泡處理結(jié)合墊30min，取出37℃下干燥2-3小時(shí)；再將結(jié)合墊加入到100μL抗體5B6標(biāo)記的熒光微球和100μL生物素化抗體15F11的混合液中，浸泡2min后取出37℃下干燥2小時(shí)；