[發明專利]農桿菌EHA105介導地細基江蘺繁枝變種轉基因方法

有效

• 申請號: 201711465054.5
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108179153B
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發明（設計）人: 王克堅;何藝賓;彭會
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;A01H1/06;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

農桿菌EHA105介導地細基江蘺繁枝變種轉基因方法，涉及細基江蘺繁枝變種轉基因的方法。將長外植體培養于含茉莉酸甲酯、激動素、2,4?D和卡那霉素的MES培養基中誘導愈傷組織，培養后，觀察并統計愈傷的誘導率；用接菌環挑取農桿菌EHA105，接種在LB液體培養基中培養，隔天按質量百分比1％～2％接種到新鮮的LB培養基中，振蕩培養，進行二次活化；當OD600為0.4～0.5時，收集菌液于無菌離心管中，離心，去上清，用無菌海水重懸，得重懸農桿菌菌液；將獲得的愈傷組織接種到重懸農桿菌菌液中培養后，愈傷組織用含羧芐青霉素、卡那霉素的無菌海水清洗后，于熒光顯微鏡中觀察GFP報告基因的表達情況及綠色熒光。

技術領域

本發明涉及細基江蘺繁枝變種轉基因的方法，尤其是涉及利用植物激素組合誘導并獲得細基江蘺繁枝變種愈傷組織，進一步運用農桿菌EHA105攜帶GFP報告基因侵染細基江蘺繁枝變種愈傷組織，從而實現GFP基因在細基江蘺繁枝變種愈傷組織中表達的農桿菌EHA105介導地細基江蘺繁枝變種轉基因方法。

背景技術

細基江蘺繁枝變種(Gracilariatenuistipitatavar.liui Zhang et Xia)隸屬于紅藻門真紅藻綱、杉藻目、江蘺科、江蘺屬；有著適應廣、耐高溫、生長快、產量高、栽培方法簡易的特點；是提取瓊膠和卡拉膠的重要工業原料，也是貝類鮑的天然餌料，具有重要的經濟價值([1]鐘晨輝等.IAA濃度對細基江蘺繁枝變種切段再生芽的誘導效果[J].福建水產.2012，Vol,34No.6)。此外，其在海藻生物修復富營養化水域、防止海區赤潮等方面具有獨特的應用價值([2]黃鶴忠等.細基江蘺繁枝變型對水體硝態氮變化的生理響應[J].海洋科學，2006，30(11):32－36)。

隨著世界經濟的發展，瓊脂的需求量逐年增加，天然產的江蘺已經無法滿足人們的需求，進行江蘺大規模的人工養殖已迫在眉睫。但江蘺人工養殖過程中容易出現藻種老化、藻體染病和不耐高溫等問題，已嚴重阻礙了江蘺人工養殖的發展。利用分子基因工程技術對江蘺藻種進行品種改良是解決當前江蘺人工養殖所產生問題的有效途徑([3]VishalGupta,Manoj Kumar,Puja Kumarietal.Optimization of protoplast yields from thered algaeGracilaria dura(C.Agardh)J.Agardh and G.verrucosa(Huds.)Papenfuss.JApplPhycol(2011)23:209–218；[4]Sook-Yee Gan,Song Qin,Rofina YasminOthmanetal.Transient expression of lacZ in particle bombardedGracilariachangii(Gracilariales,Rhodophyta).Journal of Applied Phycology 15:351–353,2003)。此外，鮑魚養殖過程中容易發生病害，人們發現通過營養手段提高鮑魚的抗病能力將是防治鮑魚病害的有效途徑。江蘺作為鮑魚的天然優質餌料，利用轉基因工程技術實現某種功能性外源蛋白(如海洋動物抗菌肽)在江蘺中高效表達，并將轉基因江蘺直接喂食鮑魚將可能提高鮑魚的抗病能力。然而，目前江蘺的基因工程研究已遠遠落后于其它大型海洋經濟藻類如紫菜等，主要原因在于缺乏一種使用方便和轉化率高的遺傳轉化體系。

發明內容

本發明的目的在于提供利用植物激素組合誘導并獲得細基江蘺繁枝變種愈傷組織，進一步運用農桿菌EHA105攜帶GFP報告基因侵染細基江蘺繁枝變種愈傷組織，從而實現GFP基因在細基江蘺繁枝變種愈傷組織中表達的農桿菌EHA105介導地細基江蘺繁枝變種轉基因方法。

本發明包括以下步驟：

1)將長外植體培養于含茉莉酸甲酯(MeJA)、激動素(KT)、2,4-D和卡那霉素的MES培養基中誘導愈傷組織，培養后，觀察并統計愈傷的誘導率；