[發(fā)明專利]農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)地細(xì)基江蘺繁枝變種轉(zhuǎn)基因方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711465054.5
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108179153B
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王克堅;何藝賓;彭會
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;A01H1/06;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)地細(xì)基江蘺繁枝變種轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于包括以下步驟：

1）將長外植體培養(yǎng)于含茉莉酸甲酯、激動素、2,4-D和卡那霉素的MES培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，培養(yǎng)后，觀察并統(tǒng)計愈傷的誘導(dǎo)率；所述長外植體為1～2cm長外植體；所述茉莉酸甲酯為20uM茉莉酸甲酯；所述激動素為0.5 mg/L激動素；所述2,4-D為2.0mg/L，所述卡那霉素為200mg/L；所述MES培養(yǎng)基為21‰ MES培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)的條件為20℃，暗，培養(yǎng)21天；

2）用接菌環(huán)挑取農(nóng)桿菌EHA105，接種在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隔天按質(zhì)量百分比1%～2%接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，進行二次活化；當(dāng)OD600為0.4～0.5 時，收集菌液于無菌離心管中，離心，去上清，用無菌海水重懸，得重懸農(nóng)桿菌菌液；所述農(nóng)桿菌EHA105攜帶植物雙元表達載體pMDC85-GFP質(zhì)粒DNA單菌落；所述LB液體培養(yǎng)基是接種在5mL含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基，21‰海水配制中；

3）將步驟1）獲得的愈傷組織接種到步驟2）中的重懸農(nóng)桿菌菌液中培養(yǎng)后，愈傷組織用含羧芐青霉素、卡那霉素的無菌海水清洗后，于熒光顯微鏡中觀察GFP報告基因的表達情況。

2.如權(quán)利要求1所述農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)地細(xì)基江蘺繁枝變種轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于在步驟2）中，所述培養(yǎng)是在28℃，200rpm 培養(yǎng)過夜；所述新鮮的LB培養(yǎng)基采用含50mg/L卡那霉素、100uM AS、21‰海水配制中；所述離心采用6500 rpm離心3min；所述用無菌海水重懸采用等體積的21‰無菌海水重懸。

3.如權(quán)利要求1所述農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)地細(xì)基江蘺繁枝變種轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于在步驟3）中，所述重懸農(nóng)桿菌菌液采用含200mg/L卡那霉素、100uM AS，所述培養(yǎng)的條件抽真空15min，25℃，黑暗，共培養(yǎng)48h。

4.如權(quán)利要求1所述農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)地細(xì)基江蘺繁枝變種轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于在步驟3）中，所述愈傷組織用含羧芐青霉素、卡那霉素的無菌海水清洗采用含250mg/L羧芐青霉素、200mg/L卡那霉素的21‰無菌海水清洗3遍。