[發(fā)明專利]不同組織中杉木內(nèi)參基因的篩選方法和篩選基因作為內(nèi)參基因的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711463831.2
• 申請(qǐng)日: 2017-12-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108085409B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李明;張穎;胡霞;吳鵬飛;帥鵬;鄒顯花;馬祥慶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

本發(fā)明提供了不同組織中杉木內(nèi)參基因的篩選方法和內(nèi)參基因的應(yīng)用，屬于熒光定量PCR檢測(cè)領(lǐng)域。所述篩選方法以甘油醛三磷酸脫氫酶基因、轉(zhuǎn)錄延伸因子、18S rRNA、28S rRNA和泛素基因?yàn)楹蜻x內(nèi)參基因，以候選內(nèi)參基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物；提取杉木苗的根、莖、葉組織的總RNA，以總RNA為模板合成cDNA；將cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，得到Ct值和相對(duì)表達(dá)量Q；根據(jù)相對(duì)表達(dá)量Q值和Ct值采用多個(gè)軟件對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)；將候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由強(qiáng)到弱排序，選擇排序前兩位的候選基因作為杉木的內(nèi)參基因。篩選得到的18S rRNA和/或泛素基因作為杉木不同組織中的內(nèi)參基因的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及不同組織中杉木內(nèi)參基因的篩選方法和篩選基因作為內(nèi)參基因的應(yīng)用。

背景技術(shù)

杉木(Cunninghamia lanceolata)是我國(guó)最重要的針葉速生用材樹(shù)種之一，具有生長(zhǎng)快、單產(chǎn)高、材質(zhì)好等特性。杉木的木材紋理通直，結(jié)構(gòu)均勻，耐腐蝕性強(qiáng)，抗蟲(chóng)性較好，被廣泛應(yīng)用于制作家具，建造橋梁、船只等方面。同時(shí)，杉木作為常綠針葉樹(shù)種，樹(shù)干通直圓滿，樹(shù)冠呈圓錐形，喜光，萌芽更新較好，生長(zhǎng)迅速，常作為園林部門推廣的優(yōu)良樹(shù)種，具有良好的景觀和園林欣賞價(jià)值。

基因的表達(dá)分析現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)的研究中，對(duì)于探求基因的表達(dá)情況、調(diào)控機(jī)理的方面均起到至關(guān)重要的作用。在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行基因的表達(dá)分析的方法，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、RNA印跡、基因芯片等，都需要內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行校正與標(biāo)準(zhǔn)化，便于獲得真實(shí)可靠的結(jié)果。然而實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性很大程度上取決于內(nèi)參基因的選擇。內(nèi)參基因穩(wěn)定性高，能更好的為目的基因的表達(dá)進(jìn)行校正。理想的內(nèi)參基因是在各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下，能在各個(gè)組織或者細(xì)胞中均能恒定表達(dá)的基因。而大量研究分析表明，大量潛在的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性也是均有相對(duì)性的，在不同的細(xì)胞類型情況下，相同的內(nèi)參基因的表達(dá)并不是恒定不變的。

近年來(lái)，植物內(nèi)參基因的篩選已有許多報(bào)道，同時(shí)越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)杉木的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，分子調(diào)控機(jī)制很大程度上依賴于目標(biāo)基因的表達(dá)情況，而目標(biāo)基因的表達(dá)情況通常采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)得到，由于杉木基因組與轉(zhuǎn)錄組序列的限制，對(duì)杉木在不同研究中的內(nèi)參基因的篩選的報(bào)道還較少，也沒(méi)有關(guān)于篩選杉木不同組織中內(nèi)參基因的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供不同組織中杉木內(nèi)參基因的篩選方法和內(nèi)參基因的應(yīng)用，所述篩選方法能夠得到在不同組織中均穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，且所述內(nèi)參能夠正確校正目的基因的表達(dá)情況。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了不同組織中杉木內(nèi)參基因的篩選方法，包括以下步驟：

1)根據(jù)候選內(nèi)參基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，得到特異性擴(kuò)增候選內(nèi)參基因的引物；

所述候選內(nèi)參基因分別是甘油醛三磷酸脫氫酶編碼基因、轉(zhuǎn)錄延伸因子、18SrRNA、28S rRNA和泛素編碼基因；

所述甘油醛三磷酸脫氫酶編碼基因具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述轉(zhuǎn)錄延伸因子具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述18S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述28S rRNA具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述泛素編碼基因具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

2)提取杉木苗的根、莖、葉組織的總RNA，以總RNA為模板合成cDNA；

3)將所述步驟2)中cDNA為模板，用所述步驟1)中引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，得到C_t值和相對(duì)表達(dá)量Q；所述相對(duì)表達(dá)量Q按照式I計(jì)算得到；

Q＝2^-△△C_t 式I