[發明專利]不同組織中杉木內參基因的篩選方法和篩選基因作為內參基因的應用

有效

• 申請號: 201711463831.2
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108085409B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 李明;張穎;胡霞;吳鵬飛;帥鵬;鄒顯花;馬祥慶
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

1.不同組織中杉木內參基因的篩選方法，包括以下步驟：

1)根據候選內參基因的核苷酸序列設計引物，得到特異性擴增候選內參基因的引物；

所述候選內參基因分別是甘油醛三磷酸脫氫酶編碼基因、轉錄延伸因子、18S rRNA、28S rRNA和泛素編碼基因；

所述甘油醛三磷酸脫氫酶編碼基因為序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述轉錄延伸因子為序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述18S rRNA為序列表中SEQID No.3所示的核苷酸序列；所述28S rRNA為序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述泛素編碼基因為序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

2)提取杉木苗的根、莖、葉組織的總RNA，以總RNA為模板合成cDNA；

3)將所述步驟2)中cDNA為模板，采用所述步驟1)中引物進行qPCR擴增，得到C_t值和相對表達量Q；所述相對表達量Q按照式I計算得到；

Q＝2^-△△C_t 式I

4)根據所述步驟3)中相對表達量Q值，采用geNorm和Normfinder軟件對所述候選內參基因進行穩定性評價；

5)根據所述步驟3)中Ct值，采用BestKeeper軟件對候選內參基因進行穩定性評價；

6)根據geNorm軟件、Normfinder軟件和BestKeeper軟件做出的穩定性評價結果，將所述候選內參基因按照穩定性由強到弱進行排序，選擇綜合排序第一的候選基因作為杉木的內參基因，所述候選基因為18S rRNA；

所述步驟1)和步驟2)之間沒有時間順序的限制，所述步驟4)和步驟5)之間沒有時間順序的限制。

2.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟1)中特異性擴增甘油醛三磷酸脫氫酶編碼基因的引物為序列表中SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；

特異性擴增轉錄延伸因子的引物為序列表中SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；

特異性擴增18S rRNA的引物為序列表中SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；

特異性擴增28S rRNA的引物為序列表中SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；

特異性擴增泛素編碼基因的引物為序列表中SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。

3.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟3)中qPCR擴增體系如下：2XqPCR反應液10μl，10X正向引物和10X反向引物各0.4μl，模板cDNA 2μl，CXR參考染料液0.2μl和ddH₂O 7μl。

4.根據權利要求1或3所述的篩選方法，其特征在于，所述3)中qPCR擴增程序：95℃預變性3min；95℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共45個循環；95℃30s，60℃30s，逐漸升溫到95℃。

5.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟6)中綜合排序的方法如下：

geNorm軟件和Normfinder軟件對候選內參基因的穩定性評價結果中，5個候選內參基因的穩定性指數M值由小到大進行排序，M值最小的候選內參基因記為5分，第二最小M值的候選內參基因記為4分，第三最小M值的候選內參基因記為3分，第四最小M值的候選內參基因記為2分，M值最大的候選內參基因記為1分；

BestKeeper軟件對候選內參基因的穩定性評價結果中，5個候選內參基因的標準差和/或變異系數由小到大進行排序，標準差和/或變異系數最小的候選內參基因記為5分，第二最小標準差和/或變異系數的候選內參基因記為4分，第三最小標準差和/或變異系數的候選內參基因記為3分，第四最小標準差和/或變異系數的候選內參基因記為2分，標準差和/或變異系數最大的候選內參基因記為1分；

將三個軟件得到的每個候選基因的得分相加，根據各候選內參基因的分值加和由大到小進行排序。

6.18S rRNA基因作為杉木不同組織中的內參基因的應用，其特征在于，所述擴增18SrRNA的引物序列為序列表中SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；所述杉木不同組織包括根、莖和葉組織；所述杉木的樹齡為一年生小苗。