[發(fā)明專利]一種提高結(jié)球甘藍(lán)低出胚基因型小孢子胚胎率發(fā)生的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711462427.3
• 申請(qǐng)日: 2017-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN108157177A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王神云;戴忠良;李建斌;王紅;于利;余方偉;唐君;秦文斌;山溪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 南京申云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32274
• 代理人: 王云

本發(fā)明公開了一種提高結(jié)球甘藍(lán)低出胚基因型小孢子胚胎發(fā)生率的方法,將芥菜、小白菜無菌花藥與結(jié)球甘藍(lán)小孢子混合懸浮液共同培養(yǎng),培養(yǎng)得到的胚狀體在初期即可確定是結(jié)球甘藍(lán)的胚狀體,因?yàn)榻Y(jié)球甘藍(lán)小孢子是游離狀態(tài)的,而芥菜、小白菜小孢子在花藥中,因此在再生植株移栽時(shí)不需要對(duì)小孢子植株群體的芥菜、小白菜植株進(jìn)行區(qū)別鑒定,從而減少了工作量,從而提高結(jié)球甘藍(lán)低出胚基因型小孢子出胚效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種提高結(jié)球甘藍(lán)低出胚基因型小孢子胚胎發(fā)生率的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleacea L.var.cap itata L.)是十字花科蕓薹屬植物的一個(gè)變種，起源于地中海沿岸，16世紀(jì)開始傳入中國。結(jié)球甘藍(lán)具有抗病、適應(yīng)性強(qiáng)、易貯耐運(yùn)、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等特點(diǎn)，由于其適應(yīng)性廣及抗逆性強(qiáng)，穩(wěn)產(chǎn)，又耐貯運(yùn)，因此在我國栽培發(fā)展很快，目前每年種植面積已達(dá)300萬hm²以上，在蔬菜周年供應(yīng)及出口貿(mào)易中都占有重要地位。

目前,我國生產(chǎn)所用的結(jié)球甘藍(lán)種子主要靠進(jìn)口,價(jià)格昂貴。選育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的結(jié)球甘藍(lán)品種,是急待解決的問題。結(jié)球甘藍(lán)屬于綠體春化型植物,兩年才能完成一個(gè)生活周期,加代繁殖十分困難。從一個(gè)雜合基因型材料起步,培育一個(gè)可用于商業(yè)制種的雜交種親本自交系,至少需要6-8年時(shí)間。結(jié)球甘藍(lán)最適宜采用單倍體育種途徑加快新品種選育進(jìn)程,游離小孢子培養(yǎng)是十字花科蕓薹屬作物近年來被開發(fā)的一條單倍體育種的有效途徑。

Lichter(1982)在甘藍(lán)油菜上首創(chuàng)的單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),目前已經(jīng)應(yīng)用于多種甘藍(lán)類植物的單倍體育種。Lichter(1989)和Takahata et.al(1990)在結(jié)球甘藍(lán)和花椰菜的游離小孢子培養(yǎng)研究中獲得了再生植株。馮輝(2007)等利用自己構(gòu)建的結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)體系,首次獲得了結(jié)球甘藍(lán)雙單倍體植株。目前,該技術(shù)在結(jié)球甘藍(lán)上的應(yīng)用還不夠成熟,受基因型等很多因素的影響較大,許多品種難以獲得胚狀體及再生植株,限制了該項(xiàng)技術(shù)在育種實(shí)踐中應(yīng)用的步伐。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種提高結(jié)球甘藍(lán)低出胚基因型小孢子胚胎發(fā)生率的方法,采用結(jié)球甘藍(lán)低出胚基因型游離小孢子與易出胚的芥菜、小白菜花藥共培養(yǎng),獲得的結(jié)球甘藍(lán)低出胚基因型小孢子平均出胚數(shù)較對(duì)照大幅度提高,且胚狀體的質(zhì)量也得到很大改善,從而提高結(jié)球甘藍(lán)低出胚基因型小孢子出胚效率。

本發(fā)明提供了一種提高結(jié)球甘藍(lán)低出胚基因型小孢子胚胎發(fā)生率的方法，主要包括以下步驟:

(1)選取結(jié)球甘藍(lán)、芥菜、小白菜處于單核晚期至雙核早期階段的干凈無污染花蕾,將花蕾保濕置于4℃處理1-3d備用；花蕾滅菌消毒用體積比75％酒精消毒60s，質(zhì)量比8％的次氯酸鈉溶液表面消毒20min,無菌水沖洗5次；

(2)將20-25個(gè)無菌結(jié)球甘藍(lán)花蕾置于無菌燒杯中,加入15-20ml pH6.0NLN-13液體培養(yǎng)基,采用擠壓法游離小孢子,然后用450目尼龍網(wǎng)過濾,將濾液收集于離心管,1000r.min^-1離心5min,棄上清液后得到沉淀,然后依次加入pH6.0NLN-13液體培養(yǎng)基,調(diào)整小孢子密度為1.5×10⁵～2×10⁵個(gè)ml^-1,并加入100μl的活性炭混合液,分裝到15-20個(gè)直徑為60mm的塑料或玻璃無菌培養(yǎng)皿中,每培養(yǎng)皿3-4ml；

(3)剝?nèi)o菌芥菜、小白菜花蕾,取出完整花藥加入到步驟(2)中的培養(yǎng)皿中,芥菜、小白菜花蕾與結(jié)球甘藍(lán)花蕾數(shù)量比為3:3:1～5:5:1,加蓋后封口；

(4)將步驟(3)中得到的加蓋封口的培養(yǎng)皿置于32.5℃恒溫培養(yǎng)箱熱激處理24h,再轉(zhuǎn)移到25℃條件下靜置黑暗培養(yǎng)15-20天至肉眼可見胚狀體出現(xiàn)后,置于搖床70-80rpm、25℃黑暗培養(yǎng)胚狀體發(fā)育到成熟的子葉型胚狀體；