[發明專利]一種提高結球甘藍低出胚基因型小孢子胚胎率發生的方法

在審

• 申請號: 201711462427.3
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108157177A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 王神云;戴忠良;李建斌;王紅;于利;余方偉;唐君;秦文斌;山溪
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 王云

1.一種提高結球甘藍低出胚基因型小孢子胚胎發生率的方法，其特征在于主要包括以下步驟:

(1)選取結球甘藍、芥菜、小白菜處于單核晚期至雙核早期階段的干凈無污染花蕾,將花蕾保濕置于4℃處理1-3d備用；花蕾滅菌消毒用體積比75%酒精消毒60s，質量比8%的次氯酸鈉溶液表面消毒20min,無菌水沖洗5次；

(2)將20-25個無菌結球甘藍花蕾置于無菌燒杯中,加入15-20ml pH6.0 NLN-13液體培養基,采用擠壓法游離小孢子,然后用450目尼龍網過濾,將濾液收集于離心管,1000r.min^-1離心5min,棄上清液后得到沉淀,然后依次加入pH6.0 NLN-13液體培養基,調整小孢子密度為1.5×10⁵~2×10⁵個ml^-1,并加入100μl的活性炭混合液,分裝到15-20個直徑為60mm的塑料或玻璃無菌培養皿中,每培養皿3-4ml;

(3)剝取無菌芥菜、小白菜花蕾,取出完整花藥加入到步驟(2)中的培養皿中,芥菜、小白菜花蕾與結球甘藍花蕾數量比為3:3:1～5:5:1,加蓋后封口;

(4)將步驟(3)中得到的加蓋封口的培養皿置于32.5℃恒溫培養箱熱激處理24h,再轉移到25℃條件下靜置黑暗培養15-20天至肉眼可見胚狀體出現后,置于搖床70-80rpm、25℃黑暗培養胚狀體發育到成熟的子葉型胚狀體；

(5)無菌條件下,將步驟(4)中得到的成熟的子葉型胚狀體轉接至胚狀體分化培養基B5培養基中,18 h.d^-1、5000Lx，24±1℃條件下培養18-20天至形成愈傷組織或直至分化出芽，再按大小將愈傷組織切成3-5塊置于生根培養基中生根培養形成再生植株, 生根培養的條件為25℃、5000Lx、16h.d^-1;

(6)步驟(5)中得到的再生株長到含4-5片葉的健壯苗時,在培養室內開瓶煉苗,馴化移栽到裝有滅菌基質的營養缽中,于25℃下12h光照和12h黑暗交替靜值培養,1周后營養缽放置外界陰涼處,逐步煉苗,3周后將其移栽到大田,獲得植株；經倍性鑒定后,獲得的純合雙單倍體再生植株用于育種。

2.根據權利要求1所述的提高結球甘藍低出胚基因型小孢子胚胎發生率的方法,其特征是，所述結球甘藍的花瓣和花藥長度比為0.5-1.0，芥菜的花瓣和花藥長度比為0.4-0.8，小白菜的花瓣和花藥長度比為0.6-0.9。

3.根據權利要求1所述的提高結球甘藍低出胚基因型小孢子胚胎發生率的方法,其特征是，在步驟（1）前分別進行周年采集結球甘藍、芥菜、小白菜花蕾供小孢子培養。

4.根據權利要求1所述的提高結球甘藍低出胚基因型小孢子胚胎發生率的方法,其特征是，所述NLN-13液體培養基組成為:NLN液體培養基1L、蔗糖125-130g，0.05 mg 6-BA,15mg AgNO₃和0.05 mg 2,4-D；pH為5.8-6.2。

5.根據權利要求1所述的提高結球甘藍低出胚基因型小孢子胚胎發生率的方法,其特征是，所述活性炭混合液的組成為:NLN液體培養基1L、瓊脂糖6-10g、活性炭4-6g。