[發明專利]一種橙紅色熒光的藍細菌光敏色素熒光標記物的制備方法

在審

• 申請號: 201711462376.4
• 申請日: 2017-12-28
• 公開（公告）號: CN108047334A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 宋建勛;任虎;夏坤;付衛雷;佟順剛
• 申請（專利權）人: 廣州天寶頌原生物科技開發有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 許飛

本發明公開了一種橙紅色熒光的藍細菌光敏色素熒光標記物的制備方法，融合蛋白包括藍細菌光敏色素蛋白alr5272的第1個GAF結構域和鏈霉親和素。本發明的融合蛋白序列，易于在微生物中穩定表達，規避了高純度天然藻膽蛋白和藍細菌光敏色素的獲取困難，制備成本較高；化學修飾劑的使用；天然藻膽蛋白聚合形態不穩定等缺點。本發明的表達方法，無需藻膽蛋白裂合酶參與，減少轉化的基因數量，提高菌種穩定性和篩選效率。同時通過優化發酵培養基和發酵條件，大大提高了融合蛋白的產量。

技術領域

本發明涉及融合蛋白表達領域，特別涉及一種光敏色素熒光標記物的制備方法。

背景技術

熒光探針(或熒光標記物)是熒光免疫檢測技術的重要基礎原料，主要是通過化學修飾法，將熒光底物同生物素-鏈霉親和素系統結合得到，可進一步放大熒光信號，提高免疫檢測的靈敏度。

天然藻膽蛋白是最常見的熒光底物之一，其天然結構一般為六聚體，亞基由脫輔基蛋白和藻膽色素，通過裂合酶催化結合而成。藻膽色素則由血紅素經過血紅素氧化酶(HO1)和各種膽綠素還原酶催化形成，常見的藻膽色素有藻紅膽素(PEB)，藻尿膽素(PUB)，藻藍膽素(PCB)和藻紫膽素(PVB)。通過結合不同的藻膽色素，藻膽蛋白吸收400nm～700nm范圍內不同波段的光后，可發出不同的熒光。

傳統的藻膽蛋白熒光探針制備流程，首先是獲取高純度天然藻膽蛋白，然后通過化學修飾法，與生物素-鏈霉親和素系統結合，進一步純化后再用于免疫檢測。但是高純度的天然藻膽蛋白獲取困難，制備成本高，同時結構不穩定，聚合形態多變。這使得藻膽蛋白熒光探針的成本居高不下。

通過微生物表達融合蛋白是一種成本較低的蛋白制備方法。然而融合蛋白的表達往往受到融合基因的設計和發酵工藝的限制，并不能穩定的表達，難以得到質量穩定的合格產品。

如何選擇合適的蛋白片斷進行融合，使其可以更為穩定地發酵生產，是有待解決的技術問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種易于表達的融合蛋白序列及其表達方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種融合蛋白，其包括藍細菌光敏色素蛋白alr5272的第1個GAF結構域和鏈霉親和素。

作為上述融合蛋白的進一步改進，融合蛋白中還添加有親和標記。

作為上述融合蛋白的進一步改進，融合蛋白的序列為：MGSSHHHHHHSQDPEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGR YDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASGSGTDDDDKAMADGESLDLETILYQTAKDLRQCLKCDRILIYQIKSDNNGAIVAESTILPNVSLLGKHFRDPCFTGKYKERQGRCCLEIIEDIYAAGVKPCQRDFLASMQVRANIVVPIALKSDLWGLLIAQYCDEPHQWQQIEIDLLKQLATQLGIAIQNTK。

表達上述融合蛋白的核苷酸序列。進一步的，核苷酸序列根據宿主菌進行密碼子優化。

插入有上述核苷酸序列的質粒。

作為上述質粒的進一步改進，質粒為pET Duet載體質粒，核苷酸序列通過酶切位點BamHⅠ、EcoRⅠ插入pET Duet載體質粒的多克隆位點1。

一種融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

1)根據上述融合蛋白的序列，設計得到融合蛋白基因序列；

2)將融合蛋白基因序列插入到質粒中，得到融合蛋白質粒；